濟(jì)源市一起致瀉大腸埃希菌引起食源性疾病的實驗室檢測及溯源分析

王軍鵬 呂品品 劉 磊 濟(jì)源市疾病預(yù)防控制中心（河南，濟(jì)源，459000）

張廣偉 河南省疾病預(yù)防控制中心（河南，鄭州，450018）

致瀉大腸埃希菌（diarrheagenic Escherichia coli，DEC）引起腸道感染致腹瀉，與食入污染的食品和飲水有關(guān)，為外源性感染［1］。根據(jù)其致病機(jī)制不同，引起胃腸炎的DEC 分為5 種類型，即腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC），腸侵襲性大腸埃希菌（enteroinvasive E.coli，EIEC），腸致病性大腸埃希 菌 （enteropathogenic E.coli，EPEC），腸出血性大腸埃希菌 （enterohemorrhagic E.coli，EHEC）和腸聚集性大腸埃希菌 （eneteroaggregative E.coli，EAEC）?？焖贆z測和鑒定病原菌是及時有效地控制與預(yù)防傳染病傳播的重要手段。DEC 的傳統(tǒng)檢測方法是分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)試驗分型，該方法的缺陷是實驗周期長，對DEC 尤其是生化非典型的菌株進(jìn)行細(xì)菌鑒定時誤檢率和漏檢率較高［2-3］。分子生物學(xué)方法以其檢測速度快、敏感度高、特異性強(qiáng)等特點，已成為對病原菌快速鑒別與分型的重要技術(shù)之一，能準(zhǔn)確檢測出病原菌攜帶的毒力基因。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一體系里加上2 對或2 對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核苷酸片段的PCR 反應(yīng)，一次反應(yīng)可檢出多種不同的毒力基因，因而擴(kuò)大了檢測范圍并提高了檢測速度［4］，且重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)。PFGE 分型技術(shù)和多重PCR 檢測可作為DEC 引起的食源性疾病診斷的參考依據(jù)。本分析呈現(xiàn)該事件實驗室檢測過程并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1 內(nèi)容和方法

1.1 內(nèi)容

1.1.1 病例定義

2020 年8 月20 日，濟(jì)源市某酒店發(fā)生一起聚集性食源性疾病。中午參加婚宴共同進(jìn)餐人數(shù)315人，截至21 日中午發(fā)病住院患者79 例。臨床表現(xiàn)為首先出現(xiàn)輕微腹痛，相繼發(fā)生惡心、腹瀉等癥狀，嘔吐癥狀較輕，腹瀉一般3～10 次，多為水樣便，并伴不同程度的低熱（≤38.5 ℃）。全部患者1～3 d 痊愈，沒有死亡病例出現(xiàn)。

1.1.2 樣本采集

開展現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查的同時，采集酒店中婚宴當(dāng)天剩余的可疑食物及住院患者的腹瀉物、肛拭子等進(jìn)行實驗室檢測。采集菜品樣品9 份（五香牛肉、大刀耳片、肘子、西芹桃仁、梅菜扣肉、烤雞、千葉豆腐、紅豆沙、熟鵪鶉蛋各1 份），砧板1 個，腹瀉物10 份，肛拭子2 份，共計22 份樣本，緊急送至濟(jì)源市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行檢測。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司和北京路橋技術(shù)股份有限公司，NID 鑒定卡購于美國BD公司，核酸提取試劑盒購于西安天隆科技有限公司，5 種致DEC 核酸多重實時熒光PCR 檢測試劑盒購于北京卓誠惠生生物科技股份有限公司，內(nèi)切酶Xba I 購于日本TaKaRa 公司，標(biāo)準(zhǔn)菌株購于廣東環(huán)凱生物有限公司。

1.1.4 檢測儀器

蘇靜安泰BSC-1304II A2 型生物安全柜、北京光明SPX-150 型生化培養(yǎng)箱、BD PhoenixTM100 全自動微生物鑒定儀、西安天隆NP968 核酸提取儀、ABI QuantStudioTM7 Flex 熒光PCR 儀，BIO-RAD 脈沖場凝膠電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查

結(jié)合現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，按照GB 4789.7—2013 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 副溶血性弧菌檢驗》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.10—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃葡萄球菌檢驗》、GB 4789.6—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行致病菌分離及培養(yǎng)。

1.2.2 致病菌的分離與初步鑒定

將分離的可疑純菌株用NID 鑒定卡經(jīng)BD PhoenixTM100 全自動微生物鑒定儀進(jìn)行初步生化鑒定，鑒定結(jié)果為大腸埃希菌。

1.2.3 細(xì)菌核酸提取

使用1 μL 接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板上經(jīng)BD PhoenixTM100 全自動微生物鑒定儀鑒定的可疑菌落，懸浮于200 μL 滅菌雙蒸水中，充分打散制成濃度108～109CFU/mL 的菌懸液備用。按照西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌核酸提取試劑盒說明書要求，用NP968 全自動核酸提取儀進(jìn)行核酸提取。取2 μL 核酸提取液做為模板。

1.2.4 5 種DEC 核酸多重實時熒光PCR 方法的建立

北京卓誠惠生生物科技股份有限公司出品的5種DEC 多重實時熒光PCR 檢測試劑盒同樣采用多重PCR 技術(shù)。對同一樣本采用A、B、C 三種PCR 反應(yīng) 體 系 對5 種DEC （EPEC、EHEC/STEC、ETEC、EIEC、EAEC）進(jìn)行檢測。A 管可用于EPEC 和EHEC/STEC 的檢測，B 管可用于ETEC 和EIEC 的檢測，C 管可用于EAEC 和大腸埃希菌種屬的鑒定。通過收集PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號，確定待測樣本是否含大腸埃希氏菌的同時，判定其致病型別。

將多重PCR 反應(yīng)條件設(shè)定為：預(yù)變性95 ℃5 min，1 個循環(huán)；變性95 ℃15 s，退火/延伸60 ℃60 s，40 個循環(huán)。“Reporter Dye”分別設(shè)置為FAM、VIC、CY5 和ROX?！癚uencher Dye”均為None。致病型別的判定標(biāo)準(zhǔn)如表1 所示。

表1 5 種DEC 毒力基因及型別判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

依照《食源性疾病PFGE 分子溯源標(biāo)準(zhǔn)操作程序》，對多重?zé)晒釶CR 檢測陽性的DEC 進(jìn)行PFGE檢測。采用沙門菌Braenderup 血清型H9812 菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株，Xba I 酶切，作為Marker。BioNumerics 軟件對PFGE 圖譜進(jìn)行聚類分析。不同基因型的判斷按照菌種間相似性系數(shù)作為同一譜型劃分依據(jù)［5］，按圖譜相識系數(shù)≥85%表現(xiàn)為克隆關(guān)系的菌株，＜85%表現(xiàn)為無克隆關(guān)系［6］。

2 結(jié)果及分析

2.1 致病菌檢測

采集病例腹瀉物10 份、肛拭子2 份、剩余菜品等10 份，共計22 份樣本中有5 份樣本分離出菌株，經(jīng)全自動細(xì)菌鑒定儀器和多重?zé)晒釶CR 檢測，結(jié)果提示為DEC 陽性。其他致病菌均未檢出。

2.2 毒力基因檢測

從2 份菜品（五香牛肉、大刀耳片）和3 份病例腹瀉物共計5 份樣本中分離鑒定出EAEC 菌株18株，其毒力基因均為uidA（+）aggR（+）astA（+）pic（+），占100.0%。ETEC、EIEC、EPEC 和EHEC 均未檢出。

2.3 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

PFGE 主要用于傳染病的流行病學(xué)研究及細(xì)菌分子分型，疾病預(yù)防控制中心利用PFGE 驗證傳染病的暴發(fā)流行，追溯傳染源及傳播途徑［7］。此次食源性疾病分離到的18 株EAEC 菌經(jīng)PFGE 檢測，采用BioNumerics 軟件聚類分析。結(jié)果提示，食品、腹瀉物樣本分離的18 株菌株為同一PFGE 型別，同源性為100.0%。

3 討論與分析

依據(jù)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查資料和實驗室檢測結(jié)果，可以確診此次突發(fā)事件是因患者食用了粘附性大腸埃希菌（EAEC）污染的肉類涼菜而引起的食源性疾病。DEC 中的EAEC 感染后臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，呈持續(xù)性水樣腹瀉，伴脫水，偶有血便［8］，低熱，通常無腹痛，很少有嘔吐，符合此次突發(fā)事件的臨床特征。EAEC 所致人體感染與宿主易感性、宿主免疫反應(yīng)、菌株毒力異質(zhì)性以及感染者所攝入的菌量有關(guān)［9］。

建國以來，在我國的食源性疾病暴發(fā)事件中，致病原因不明的急性胃腸炎占20%左右［10-12］，且癥狀相似，病因多樣。DEC 引起的食源性疾病鮮有報道，經(jīng)典的實驗室細(xì)菌檢測用培養(yǎng)法，雖然可靠但耗時長［13］，而且不能有效地區(qū)分DEC 和非DEC，檢驗結(jié)果并不能作為是否有致病能力的依據(jù)，只能說某個血清型可能與致病相關(guān)。因此在傳統(tǒng)檢測方法的基礎(chǔ)上，有必要進(jìn)行大腸埃希菌的毒力基因檢測。多重?zé)晒釶CR 檢測具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、效率高和成本低等特點，目前已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。本次事件中，通過構(gòu)建多重檢測體系不僅可以確定可疑菌株是否為大腸埃希菌，還能判定其致病性，為DEC 的監(jiān)控、檢測及溯源等提供了參考依據(jù)。

PFGE 具有技術(shù)成本小、技術(shù)門檻低、可重復(fù)性高和實驗室間比對性好等特點，在各類突發(fā)公共衛(wèi)生事件（例如院內(nèi)感染、食源性疾病暴發(fā)和細(xì)菌學(xué)傳染病暴發(fā)）中得到廣泛應(yīng)用，成為目前細(xì)菌流行病學(xué)溯源研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”［14］。本事件用PFGE 分型技術(shù)對分離的可疑DEC 進(jìn)行分子分型與聚類分析，提示其同源性為100.0%。根據(jù)Tenover 等［5］的原則判定，從所采剩余涼菜和患者腹瀉物中分離的菌株為同一PFGE 型。

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，致病菌溯源已進(jìn)入生物信息時代，食源性致病菌的鑒定及事件溯源更多地通過基因型別、分子型別或全基因組測序方式獲得更精準(zhǔn)的結(jié)果［15］。在食源性疾病的溯源分析中，可結(jié)合多重PCR 技術(shù)和PFGE 分型技術(shù)，綜合作為實驗室確診的參考判定依據(jù)，對事件的分析及判定更有意義，更能提高不明原因食源性疾病的診斷率，真正發(fā)揮實驗室檢測的技術(shù)支撐作用。