1個(gè)脆性X綜合征家系的FMR1基因CGG重復(fù)及甲基化狀態(tài)分析*

鐘青燕，劉曉麗，羅世強(qiáng)，袁德健，王敬仁，王秋華b，黃鈞b，嚴(yán)提珍（柳州市婦幼保健院 ＆ 廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院 .醫(yī)學(xué)遺傳科，b.柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c.柳州市生殖與遺傳研究所，廣西柳州 545001）

脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）作為最常見的X連鎖的智力低下綜合征，是發(fā)病率僅次于唐氏綜合征的第二大智力低下疾?。?］，同時(shí)也是孤獨(dú)癥譜系障礙常見的遺傳因素。人群發(fā)病率男性約 1／4 000，女性約為 1／8 000［2-3］。約 99%的脆性X綜合征患者發(fā)病的分子機(jī)制是由于FMR1 基因5′端非編碼區(qū)的三核苷酸重復(fù)序列CGG過(guò)度擴(kuò)增引起其上游約250 bp處CpG島發(fā)生不同程度的異常甲基化，從而抑制FMR1 基因正常轉(zhuǎn)錄，造成FMR1不表達(dá)或低表達(dá)，進(jìn)而引起一系列的臨床癥狀。絕大部分男性全突變患者有典型脆性X 綜合征的臨床表現(xiàn)，也有30%～50%女性全突變攜帶者表現(xiàn)為輕重程度不等的智力低下，嚴(yán)重程度明顯低于男性［4］。目前脆性X 綜合征的相關(guān)研究更多的是關(guān)注患者的CGG 重復(fù)數(shù)或甲基化情況，對(duì)甲基化程度和表型關(guān)系研究的較少，本研究應(yīng)用PCR微流控芯片毛細(xì)管電泳聯(lián)合MS-MLPA技術(shù)對(duì)脆性X綜合征家系進(jìn)行CGG重復(fù)序列和甲基化狀態(tài)分析，同時(shí)探討甲基化程度和臨床表型的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年8月于柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科遺傳咨詢的1 個(gè)脆性X 綜合征家系，5代共22人（家系圖譜見圖1）。先證者（Ⅳ4）為男性，21歲，表現(xiàn)為特殊面容（長(zhǎng)臉、大耳朵）、智力障礙、自閉癥、社交障礙等臨床表現(xiàn)，另外3 名男性患者（Ⅳ5、Ⅳ6 和Ⅳ9）和先證者有相似的臨床癥狀，其余家系成員未發(fā)現(xiàn)有類似臨床表現(xiàn)（表1）。本研究經(jīng)柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)審批（批準(zhǔn)文號(hào)：20160227042），所有研究對(duì)象或家屬均知情同意。

圖1 脆性X綜合征家系圖

1.2 樣本采集與處理 采集先證者及家系成員外周血2～3 mL于EDTA-K2真空抗凝管中，顛倒混勻用于DNA提取及PCR擴(kuò)增。

1.3 主要儀器及試劑 Chemagic360 全自動(dòng)提取儀、LabChip FGX微流控毛細(xì)管電泳儀、FMR1 基因檢測(cè)試劑盒（PCR 微流控芯片毛細(xì)管電泳法）、核酸提取試劑盒（蘇州新波公司），3500Dx 遺傳分析儀（美國(guó)ABI公司）。SALSA MLPA ME029 試劑盒（荷蘭 MHC-Holland 公司），QIAampDSP 全血 DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）。

1.4 方法

1.4.1 DNA 樣本準(zhǔn)備 使用核酸提取試劑盒，在Chemagic360全自動(dòng)提取儀上提取受試者外周血基因組DNA，提取的基因組DNA用于PCR反應(yīng)。使用QIAampDSP 全血DNA 提取試劑盒提取基因組DNA用于Southern 印記雜交。所有實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.2 PCR 微流控芯片毛細(xì)管電泳技術(shù) 使用FMR1基因檢測(cè)試劑盒（PCR微流控芯片毛細(xì)管電泳法）進(jìn)行FMR1基因檢測(cè)，對(duì)受試者基因組DNA進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系共 20 μL，包括 FX反應(yīng)液 15 μL，F(xiàn)X 稀釋液 3.8 μL，F(xiàn)X 聚合酶0.2 μL，DNA 模板 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min，98 ℃變性 35 s，61 ℃ 退火 35 s，72 ℃ 延伸4 min，共 25 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸 10 min。將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸純化，具體操作步驟參見試劑盒說(shuō)明書。純化后的PCR產(chǎn)物在LabChip FGX 微流控毛細(xì)管電泳儀上進(jìn)行PCR產(chǎn)物片段大小分析。將所得的樣本核酸片段大小等信息導(dǎo)入FMR1 基因檢測(cè)報(bào)告軟件，根據(jù)軟件說(shuō)明書對(duì)數(shù)據(jù)自動(dòng)進(jìn)行分析和擬合，計(jì)算出CGG 重復(fù)數(shù)。本研究同時(shí)采用已知重復(fù)數(shù)的參考樣本（質(zhì)控DNA，5 個(gè)不同CGG重復(fù)數(shù)的 DNA 片段，29／43／56／100／375 CGG 重復(fù)數(shù)）構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣本核酸片段大小通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到更高精度的CGG重復(fù)數(shù)。CGG重復(fù)數(shù)按照美國(guó)人類遺傳學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics，ACMG）指南［5］對(duì)基因型進(jìn)行分型：正常型（CGG 重復(fù)次數(shù)＜45）；前突變型（CGG重復(fù)次數(shù)為55 ～200）以及全突變型（CGG 重復(fù)次數(shù)＞200）。

1.4.3 MS-MLPA 檢測(cè) 采用 SALSA MLPA ME029試劑盒檢測(cè)樣本FMR1 基因缺失和重復(fù)及FMR1基因上游CpG島甲基化狀態(tài)。具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書操作。參照文獻(xiàn)［6］，用3500Dx遺傳分析儀進(jìn)行產(chǎn)物分析，原始數(shù)據(jù)通過(guò)Coffalyzer.Net軟件（荷蘭MRC-Holland 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化分析。將FMR1基因7個(gè)甲基化特異性探針比值的平均值作為甲基化比值。男性甲基化比值為0，表明不存在甲基化，甲基化比值＞0.64表明存在異常甲基化。

1.4.4 Southern 印記檢測(cè) 所有全突變陽(yáng)性樣本均送到中南大學(xué)生命科學(xué)院遺傳研究中心進(jìn)行Southern 印記雜交驗(yàn)證［7］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α ＝0.05，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR微流控芯片毛細(xì)管電泳結(jié)果 22個(gè)家系成員中檢出正常型9例（1男，8女），檢出女性前突變攜帶者8例，其FMR1 基因CGG 重復(fù)數(shù)在100 ～128 之間，其中 1 例 （12.5%）卵巢早衰，5 例（62.5%）女性前突變攜帶者出現(xiàn)月經(jīng)紊亂，明顯高于正常型（25%）；檢出脆性X 綜合征男性患者4例，全突變女性攜帶者1 例，均由前突變攜帶者母親動(dòng)態(tài)突變傳遞而來(lái)。22個(gè)家系成員的CGG重復(fù)數(shù)見表1、部分家系成員PCR微流控芯片毛細(xì)管電泳圖譜見圖2。

圖2 PCR微流控芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)FMR1基因電泳圖

2.2 MS-MLPA檢測(cè)結(jié)果 22例家系成員MS-MLPA分析，均未發(fā)現(xiàn)FMR1基因缺失和重復(fù)。男性正常型甲基化比值為0，女性正常型和前突變攜帶者甲基化比值范圍分別為 0.25 ～0.48（中位數(shù) 0.33）和0.33～0.46（中位數(shù) 0.38），兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝ 0.095，P＞0.05）；1 例女性全突變攜帶者（Ⅳ：16）甲基化比值為0.52，高于正常型和前突變攜帶者中位數(shù)（0.33，0.38）；4 例男性全突變患者（Ⅳ：4、Ⅳ：5、Ⅳ：6、Ⅳ：9）CpG 島為異常甲基化狀態(tài)，甲基化比值均＞0.64（表1）。部分圖譜見圖3。

圖3 MS-MLPA檢測(cè)FMR1基因缺失、重復(fù)和甲基化狀態(tài)的圖譜

表1 22個(gè)家系成員的CGG重復(fù)數(shù)，MS-MLPA結(jié)果及臨床表現(xiàn)

續(xù)表1

2.3 Southern印跡雜交結(jié)果 4例男性脆性X綜合征患者均出現(xiàn)＞5.8 Kb條帶（男性全突變型），1例女性全突變攜帶者出現(xiàn) 2.8 Kb、5.2 Kb 和＞5.8 Kb 條帶（女性全突變型）。

3 討論

FMR1基因CGG 重復(fù)數(shù)的動(dòng)態(tài)突變遞增僅遵循母源傳遞，父源傳遞時(shí)一般不發(fā)生大范圍遞增反而縮減，Mulley等［8］報(bào)道1例中度智力低下的脆性X綜合征（FXS）男性患者生育的女兒表現(xiàn)為前突變型，Kambouris 等［9］發(fā)現(xiàn) 1 例前突變和全突變嵌合男性生育的女兒也表現(xiàn)為前突變型，其CGG 重復(fù)數(shù)跟父親一樣，Willems 等［10］發(fā)現(xiàn) 1 例表型正常的全突變甲基化嵌合男性其精子CGG重復(fù)數(shù)與女兒相同，段然慧等［11］通過(guò)對(duì) 2 例 FXS 男性胎兒（1例全突變、1 例全突變和前突變嵌合）睪丸組織進(jìn)行CGG重復(fù)數(shù)及甲基化水平檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)父源CGG重復(fù)數(shù)在子代傳遞呈現(xiàn)縮減漸進(jìn)過(guò)程。本研究的家系中Ⅲ代的女性成員均為前突變攜帶者，CGG重復(fù)數(shù)在100～128 之間，其母親（Ⅱ：2 和Ⅱ：4）為正常型，因父親已故，根據(jù)咨詢者反饋其父親臨床表現(xiàn)無(wú)特殊，推測(cè)前突變攜帶者的父親可能表現(xiàn)為前突變，父親CGG 重復(fù)傳給其女兒時(shí)發(fā)生了較小的遞增或保持一致。

前突變CpG島一般不發(fā)生甲基化，F(xiàn)MR1 基因可以正常地轉(zhuǎn)錄，具有相對(duì)正常的蛋白質(zhì)水平，不表現(xiàn)出脆性X綜合征臨床癥狀，但是可能會(huì)與老年性震顫、共濟(jì)失調(diào)和卵巢早衰、卵巢功能不全等發(fā)生相關(guān)。脆性X相關(guān)震顫／共濟(jì)失調(diào)綜合征（fragile X-associated tremor／ataxia syndrome，F(xiàn)XTAS）可能是由于過(guò)多的RNA結(jié)合蛋白的毒性作用引起的一組以神經(jīng)退行性病變?yōu)橹鞯募膊。?2-13］。約40%或以上前突變攜帶者在60歲之后罹患遲發(fā)型進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病——FXTAS，此病好發(fā)于男性，年紀(jì)越大發(fā)病率越高［14］。本研究中的 1 例女性（Ⅱ：2，CGG重復(fù)數(shù)為29／38）在66 歲開始出現(xiàn)老年性震顫、共濟(jì)失調(diào)，排除了脆性X綜合征基因變異，其臨床癥狀的出現(xiàn)可能是其他神經(jīng)系統(tǒng)病變引發(fā)。前突變攜帶者中有20%罹患卵巢早衰的風(fēng)險(xiǎn)，卵巢早衰的發(fā)生可能是由于前突變mRNA 對(duì)卵巢組織的毒性積累導(dǎo)致卵泡閉鎖或凋亡增加［15］。女性前突變攜帶者CGG 重復(fù)數(shù)在55 ～80 之間時(shí)，重復(fù)數(shù)越大，發(fā)生卵巢早衰的年齡越小，CGG 重復(fù)數(shù)大于80時(shí)發(fā)生卵巢早衰的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高；然而CGG 重復(fù)數(shù)大于或等于100 時(shí)幾乎不再增加卵巢早衰的風(fēng)險(xiǎn)，反而還會(huì)下降［15］。本研究中8 例女性前突變攜帶者的CGG重復(fù)數(shù)均大于或等于100，只有1例（Ⅲ：9）出現(xiàn)卵巢早衰，在 40 歲絕經(jīng)，發(fā)生率為12.5%，這可能與其CGG重復(fù)數(shù)不屬于卵巢早衰的高發(fā)區(qū)間有關(guān)；另外有5例（62.5%）女性前突變攜帶者出現(xiàn)月經(jīng)紊亂，高于正常型女性，可能跟前突變mRNA毒性作用有關(guān)系，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究采用MS-MLPA 技術(shù)進(jìn)行甲基化分析，女性正常型和前突變攜帶者甲基化比值范圍為0.25～0.48 和 0.33 ～ 0.46，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.095，P＞0.05），1 例女性全突變攜帶者甲基化比值為 0.52，高于女性正常型和前突變型均值（0.33，0.38），其未出現(xiàn)脆性 X 綜合征相關(guān)的臨床癥狀。由于存在無(wú)活性、甲基化的X 染色體，在正常型和全突變型之間產(chǎn)生重疊的峰值比率，女性樣本MS-MLPA分析時(shí)得不到可靠的結(jié)果，因此，女性陽(yáng)性樣本需采用Southern 印跡雜交法結(jié)合PCR 微流控芯片毛細(xì)管電泳進(jìn)行綜合分析。4 例男性全突變患者甲基化比值均＞0.64，為高度異常甲基化狀態(tài)，其中2例表現(xiàn)為中度智力障礙，2例為重度智力障礙，兩組患者的甲基化比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.58，P＞0.05），提示男性患者的臨床表型和甲基化程度有關(guān)，但非正相關(guān)。Nobile 等［16］發(fā)現(xiàn)DNA甲基化不是調(diào)節(jié)FMR1表達(dá)的唯一因素，胞嘧啶甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重組、RNA轉(zhuǎn)錄的作用也可影響FMR1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

通過(guò)CGG 重復(fù)數(shù)檢測(cè)和甲基化分析，為脆性X綜合征家系成員提供準(zhǔn)確全面的分子診斷，男性患者臨床表型和甲基化程度相關(guān)。前突變和全突變女性的FMR1基因CGG 重復(fù)數(shù)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)突變遞增傳給子代，有生育脆性X 綜合征患兒的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在婚前、孕前進(jìn)行遺傳咨詢和基因檢測(cè)，若是女性攜帶者，可通過(guò)產(chǎn)前診斷或胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)避免患兒的出生。此外，女性攜帶者有卵巢早衰的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)提供風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，必要時(shí)提前完成生育計(jì)劃。