1 058例初診急性白血病患者46種融合基因篩查分析

鄒媛，唐遠燕，杜翠，董越，郭福曉，程建兵（杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司病理實驗室，杭州 310030）

白血?。╨eukemia）是一組高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率約為2.67／10萬，急性和慢性的發(fā)病率比值約 5.5 ∶1［1］。在 2017 年修訂的第四版《WHO 造血與淋巴組織腫瘤分類》中，急性白血?。╝cute leukemia，AL）分為三大類：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML），急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性系列未明白血?。╝cute leukemia of ambiguous lineage，ALAL）。同時根據(jù)免疫表型、細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)現(xiàn)，定義了多個亞類［2］。其中，融合基因是常見且重要的重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常，它對AL 的診斷、預(yù)后及治療都具有指導(dǎo)意義。本研究通過回顧分析1 058 例AL 初診患者樣本46 種常見融合基因的檢測結(jié)果，以明確AL 患者中融合基因的分布情況，并探討46種融合基因篩查的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 收集 2017 年 4 月至 2021 年 6 月送檢至杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心實驗室檢測46 種融合基因篩查的樣本中，明確診斷為AML、ALL 及ALAL的患者共1 058例，年齡1 個月～93 歲，中位年齡11歲。男性樣本582 例，女性樣本474 例，性別不詳2例；骨髓946 例，外周血35 例，類型不明的全血樣本77例。其中AML 499 例，中位年齡46歲；ALL 510例，中位年齡5歲；ALAL 49例，中位年齡10歲。經(jīng)杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（倫理審查編號：ADICON 醫(yī)倫審［2021］第005號）。其中臨床診斷來自送檢醫(yī)院或本中心血液病綜合診斷室。

1.2 儀器和試劑 ABl7500熒光PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。SuPerfecTRITMTotal RNA isolation Reagent購自上海普飛生物技術(shù)公司，ReverTra Ace qPCR RT Kit 和Thunderbird qPCR Mix試劑購自東洋紡（上海）生物科技公司。引物購自通用生物系統(tǒng)（安徽）公司。

1.3 方法

1.3.1 全血RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 通過多重熒光PCR法篩查46種融合基因［3-5］：按表1所列進行分組檢測。引物探針序列部分參考文獻［6］，另外一部分為本實驗室通過Genamics Expression 軟件設(shè)計；與篩查方法一并申請了專利［3-5］。每組總反應(yīng)體系為50 μL，包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 25 μL，cDNA 5 μL，10 μmol／L 引物探針混合物，RNase-free dH2O補足至50 μL。檢測程序及結(jié)果分析參考專利［3-5］。MECOM 基因表達通過ΔΔCt＝ΔCt待檢EVI1－ΔCt正常EVI1計算判定［7］；當 ΔΔCt＞3SD正常EVI1時為高表達。當少見的融合基因首次檢測到陽性時，比對相應(yīng)的染色體核型分析結(jié)果；若不一致或無對應(yīng)的染色體核型分析結(jié)果時，在樣本量足夠的前提下進行Sanger測序再次確認。

表1 融合基因篩查列表

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.3.2.1 統(tǒng)計 1 058 例樣本的 46 種融合基因篩查結(jié)果 分別計算AML、ALL及ALAL患者樣本中各種融合基因的陽性率，比較相同融合基因在AML和ALL患者中的分布差異。將患者按年齡分成＜18歲、18～59歲和≥60歲3組，比較不同年齡段患者的融合基因陽性率情況。

1.3.2.2 MECOM 表達的分組 將患者按 KMT2A重排陽性、NUP98 家族融合基因陽性、復(fù)雜核型（除包含KMT2A重排和NUP98 家族融合基因的病例）及其他（剩余的樣本）進行分組，統(tǒng)計MECOM高表達在上述分組中的分布差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 IBM SPSS Statistics 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理分析，分布差異采用卡方（χ2）檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各類疾病中融合基因的陽性率 499 例AML樣本檢測出251 例陽性，含20 種融合基因（1 例BCR-ABL1和 RUNX1-MECOM 雙陽性）；檢出率為50.30%。510例ALL樣本檢測出241例陽性，含12種融合基因（1 例為首次發(fā)現(xiàn)的PCM1-FGFR1 陽性，測序結(jié)果見圖 1A）；檢出率為 47.25%。49 例ALAL樣本檢測出8例陽性，含5種融合基因；檢出率為16.33%。部分少見融合基因測序圖譜見圖1B～1D；融合基因在各類疾病中的分布情況見圖2。

圖1 測序驗證圖譜

圖2 AL患者中融合基因的分布情況

2.2 融合基因在AML 和ALL 患者中的分布差異NUP98家族融合基因只分布于 AML（P＜0.01）；而MECOM高表達和KMT2A重排相關(guān)融合基因在AML 中的陽性率顯著高于 ALL（P ＜0.01）；但KMT2A-AFF1 融合基因只出現(xiàn)于 ALL（P ＜0.01）。FUS-ERG融合基因雖多見于AML，但與ALL 相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。其他融合基因在AML和ALL中的分布差異見圖3。

圖3 融合基因在AML和ALL患者中的分布差異

2.3 不同年齡段患者的融合基因陽性率 在AML患者中，年齡＜18 歲、18 ～59 歲和≥60 歲 3 組之間的融合基因陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）；在 ALAL 患者中，年齡＜18 歲和 18 ～59 歲組之間的融合基因陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在ALL患者中，上述3 個年齡段的融合基因陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 MECOM高表達樣本的差異性分布 和其他組相比，MECOM 高表達在 KMT2A 重排（P＜0.01）、NUP98 家族（P＜0.01）和復(fù)雜核型（P＜0.05）中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義。KMT2A 重排、NUP98 家族和復(fù)雜核型組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。MECOM的表達水平在不同融合基因或核型中的分布比例見表3。

表3 MECOM的表達水平在不同融合基因／核型中的分布差異

表2 各類疾病中不同年齡段的融合基因的比較

3 討論

融合基因是AL 中常見的重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常，有文獻報道，在年輕成人AML 中的檢出率約為34%［8］，在 BCP-ALL 中的檢出率約為 50%［9］；對初診患者進行常見融合基因篩查利于及時診斷和評估預(yù)后，并確定微小殘留病灶監(jiān)測的分子靶標［6］。近幾年國內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)多重熒光PCR 法篩查融合基因的商品化試劑，但檢測的融合基因種類一般為30種左右，數(shù)量相對不足［10］。本研究增加了NUP98家族融合基因、JAK2 及FGFR1 重排相關(guān)融合基因及NUP214-ABL1 等融合基因，以提高融合基因篩查的陽性率。

在AML患者中，不同年齡段的融合基因陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。＜18 歲的年齡組，融合基因陽性率更是高達83.4%，這一數(shù)據(jù)與黃倩雯等［10］報道的≤14歲兒童AML融合基因陽性率（75.5%）接近；隨著年齡的增加，融合基因的陽性率逐漸降低。在ALAL組中，18～59歲患者的融合基因陽性率顯著高于＜18 歲，與 AML 呈現(xiàn)相反的趨勢。而在ALL 組中各個年齡段的融合基因陽性率無顯著性差異。這一結(jié)果是否意味著不同年齡群驅(qū)動AML和ALAL發(fā)生的主要因素是在變化的，值得探討。

在AML和ALL中，有10種融合基因的分布是有顯著性差異的。除了PML-RARA、RUNX1-RUNX1T1等常見融合基因只出現(xiàn)于AML 外，本研究檢測出9例NUP98家族融合基因陽性，4 例兒童，5 例成年，均為AML患者。研究表明［11-13］，伴有NUP98 融合基因的患者預(yù)后不良。McNeer 等［12］的研究顯示，約50%的化療耐藥的兒童AML 患者伴有NUP98融合基因。這類患者還常同時伴有FLT3-ITD 和／或 WT1 的突變［11，13］。Ostronoff 等［13］的報道顯示，同時伴有NUP98融合與FLT3-ITD 突變的AML 患者組的復(fù)發(fā)率和死亡率是無上述遺傳異?；颊呓M的2倍。并且NUP98融合多為隱匿性的遺傳學(xué)異常，常規(guī)染色體檢查易造成漏檢［11］。因此，將NUP98融合納入常規(guī)AML相關(guān)融合基因的檢測是有必要的。

MECOM高表達主要見于 AML，是 AML 患者生存的一個獨立的不良預(yù)后指標，與3q26 重排的存在無關(guān)［7］。MECOM 高表達與預(yù)后不良的核型（如-7／7q-）或復(fù)雜核型相關(guān)，也與 KMT2A 重排具有顯著相關(guān)性［7，14］，與本研究觀察到的結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)伴NUP98 融合的患者MECOM高表達率也顯著增高，這在少量病例報道中也有提及［15］，充分證實了MECOM高表達與疾病不良后果存在相關(guān)性。在初診AML患者中進行MECOM 基因高表達的篩查，可能有助于更好的風(fēng)險分層和治療調(diào)整。此外，本研究中MECOM 高表達也見于2.16%的ALL患者，雖然其在ALL預(yù)后評估中的意義并沒有在AML中如此明確，但在ALL的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［16］。

KMT2A重排是AL中常見的融合基因，因其伴侶基因眾多，需要大范圍地進行篩查。本研究僅對常見的 12 種進行檢測，其中 KMT2A-MLLT3、KMT2A-MLLT1 和 KMT2A-AFF1 是最為常見的類型。KMT2A 重排在 AML 中的陽性率顯著高于ALL，且類型也較多。但是KMT2A-AFF1 融合基因只出現(xiàn)于ALL和ALAL，對疾病的輔助診斷具有重要的指導(dǎo)意義。此外，筆者在ALL 中檢測出1 例PCM1-FGFR1 陽性樣本。Kasbekar 等［17］也報道在伴有嗜酸性粒細胞增多的髓系腫瘤中發(fā)現(xiàn)了該融合基因，并通過口服選擇性小分子FGFR1-4抑制劑（Futibatinib）獲得持久的血液學(xué)和細胞遺傳學(xué)完全緩解。此外，本研究還檢測出2 例NUP214-ABL1陽性和1 例ETV6-ABL1 陽性樣本，這類伴ABL1 重排陽性的ph樣ALL患者可從達沙替尼（Dasatinib）等酪氨酸激酶抑制劑治療中獲益［18］，上述融合基因的檢測可為臨床提供更合適的治療方案。

綜上所述，46種融合基因篩查有助于急性白血病的診斷分型，預(yù)后評估及治療指導(dǎo)。目前尚有許多種融合基因并未納入《WHO 造血與淋巴組織腫瘤分類》中作為具有重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常的分類標志，希望隨著臨床病例數(shù)的增加及其臨床特征的總結(jié)歸納，越來越多的融合基因檢測結(jié)果可以為臨床血液疾病的診治提供幫助。