ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286位點(diǎn)基因多態(tài)性與尤文肉瘤患者化療耐藥及肺部感染的關(guān)系

柴艷梅，鄒龍，柴曉婧（.荊門(mén)市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊門(mén) 448000；.荊門(mén)市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北荊門(mén) 448000）

尤文肉瘤（Ewing′s sarcoma，EWS）是起源于骨骼或軟組織的惡性腫瘤，常見(jiàn)于兒童和青少年［1］?；熓怯任娜饬龅某Ｒ?jiàn)治療方案，可顯著改善尤文肉瘤患者的預(yù)后。然而，關(guān)于尤文肉瘤化療耐藥和肺部感染的機(jī)制尚不清楚。既往研究發(fā)現(xiàn)，尤文肉瘤患者的遺傳背景如單核苷酸多態(tài)性（SNP）等可影響化療藥物在機(jī)體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致不同基因型患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)性不同［2］。文獻(xiàn)報(bào)道，ATP 結(jié)合盒 B 亞家族成員1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）基因的多態(tài)性可影響長(zhǎng)春新堿的化療效果［3］。此外，尤文肉瘤患者免疫功能低下，更易發(fā)生肺部感染，而肺部感染可進(jìn)一步加劇腫瘤的進(jìn)展。因此，預(yù)防肺部感染是改善尤文肉瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵。研究表明，Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）和白細(xì)胞介素10（interleukin 10，IL-10）基因多態(tài)性與多種感染密切相關(guān)，但其與尤文肉瘤化療患者并發(fā)肺部感染關(guān)系的報(bào)道少見(jiàn)［4］。因此，本研究旨在分析ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和 IL-10 rs1554286位點(diǎn)基因多態(tài)性與尤文肉瘤患者化療耐藥及并發(fā)肺部感染的關(guān)系，以期為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取 2017 年 1 月至 2019 年 1 月荊門(mén)市第二人民醫(yī)院就診的80例尤文肉瘤患者為研究對(duì)象。男 38 例，女 42 例，年齡 （24.34±4.76）歲。診斷依據(jù)《尤文肉瘤腫瘤家族（ESFT）臨床循證診療指南》［5］，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）MRI 提示 EWS 并經(jīng)穿刺組織學(xué)證實(shí)；（2）發(fā)生部位在骨盆或下肢。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）轉(zhuǎn)移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)者；（2）存在化療禁忌者；（3）預(yù)計(jì)生存期短于3 個(gè)月者；（4）身體基礎(chǔ)條件差者?；煼桨讣澳退幣c肺部感染的評(píng)價(jià)：采用伊立替康＋長(zhǎng)春新堿化療方案，以20 mg／m2／d的劑量靜脈滴注伊立替康90 min，持續(xù)5 d，長(zhǎng)春新堿的劑量為在第1天和第8天靜脈滴注1.4 mg／m2，化療持續(xù) 14 d?；熋舾行缘脑u(píng)價(jià)參見(jiàn)實(shí)體腫瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1 版，化療療效分為完全緩解（CR）16 例、部分緩解（PR）6 例、疾病進(jìn)展（PD）18例和疾病穩(wěn)定（SD）40 例。化療敏感定義為CR＋PR，化療耐藥定義為PD＋SD。肺部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家衛(wèi)生部《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。本研究經(jīng)荊門(mén)市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)（No.JMSDERMYY-2016071）審核批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 試劑和儀器 ABI QuantstudioTMDX定量PCR儀、ABI Ion Proton Torrent二代測(cè)序儀基因及Orion紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，DNA提取試劑盒（G1N70）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 標(biāo)本采集 于各患者化療前采集晨起空腹靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，用于基因多態(tài)性檢測(cè)。無(wú)法及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本置于－80 ℃保存。

1.4 DNA 提取 按 DNA 提取試劑盒（G1N70）說(shuō)明書(shū)操作提取樣本DNA。取DNA 吸光度（A260nm／A280nm）值在 1.8 ～ 2.0 之間，濃度為 5 ～ 15 ng／μL 的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 引物設(shè)計(jì)及熒光定量 PCR ABCB1、TLR4 和IL-10引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［6-8］。ABCB1 rs10276036基因多態(tài)性PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括反應(yīng)液23 μL 和模板 DNA 2 μL。TLR4 rs11536889 基因多態(tài)性PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括反應(yīng)液18 μL和模板 DNA 2 μL。PCR 總反應(yīng)體系為 20 μL，包括PCR反應(yīng)液18 μL和模板DNA 2 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共 55 個(gè)循環(huán)，采用 QuantStudio Design ＆ Analysis 軟件分析熔解曲線(xiàn)并進(jìn)行結(jié)果判讀。ABCB1 rs10276036位點(diǎn)包括 3 種基因型：CC、CT 和 TT，TLR4 rs11536889 位點(diǎn)包括3種基因型：CC、CT和TT，IL-10 rs1554286位點(diǎn)包括3種基因型：GG、GA和AA。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分類(lèi)變量以率來(lái)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析SNP 和相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。計(jì)算ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 位點(diǎn)基因型的頻率，并分析數(shù)據(jù)是否符合Hardy-Weinberg 平衡定律。以D′表示連鎖不平衡的程度，使用SNPStats（https：／ ／www.snpstats.net）軟件在線(xiàn)完成分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和IL-10 rs1554286基因多態(tài)性分析結(jié)果 80 例尤文肉瘤化療患者ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 位點(diǎn)分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝ 4.253，P ＞ 0.05），具有群體代表性。ABCB1 rs10276036位點(diǎn)中CC 基因型占比高于CT和 TT 基 因 型 （χ2＝ 93.863，P ＜ 0.001），TLR4 rs11536889位點(diǎn)中GG 基因型占比高于GC 和CC基因型（χ2＝ 60.788，P＜0.001），IL-10 rs1554286 位點(diǎn)中GG 基因型占比高于 GA 和 AA 基因型（χ2＝41.213，P＜0.001），見(jiàn)表 1 和表 2。

表1 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286位點(diǎn)基因型分布

表2 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286位點(diǎn)等位基因分布

2.2 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286基因型與化療耐藥的關(guān)系 與CT／TT基因型相比，ABCB1 rs10276036 位點(diǎn)CC 基因型出現(xiàn)化療耐藥的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝ 4.096，P ＝0.043）。與 GC／CC 基因型相比，TLR4 rs11536889位點(diǎn)GG 基因型出現(xiàn)化療耐藥的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝ 0.696，P ＝ 0.404）。IL-10 rs1554286 位點(diǎn)GG基因型與GA／AA基因型出現(xiàn)化療耐藥相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.376，P ＝0.540），見(jiàn)表 3。

表3 ABCB1 rs10276036和TLR4 rs11536889基因型與化療耐藥的關(guān)系

2.3 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286 基因型與肺部感染的關(guān)系 ABCB1 rs10276036位點(diǎn)CC 基因型與 CT／TT 基因型肺部感染發(fā)生率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.883，P ＝0.347）。TLR4 rs11536889 位點(diǎn)的 GG 基因型與GC／CC 基因型患者肺部感染發(fā)生率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2＝ 4.581，P ＝ 0.032）。IL-10 rs1554286位點(diǎn)的 GG 基因型與 GA／AA 基因型患者肺部感染發(fā)生率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.123，P ＝0.013），見(jiàn)表 4。

2.4 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286 位點(diǎn)之間連鎖不平衡分析 利用SNPStats 軟 件 對(duì) ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。ABCB1 rs10276036和TLR4 rs11536889兩位點(diǎn)處于連鎖不平衡狀態(tài)（D′＝ 0.89，P ＜0.05），TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 也處于連鎖不平衡狀態(tài)（D′＝0.91，P＜0.05），ABCB1 rs10276036和IL-10 rs1554286位點(diǎn)處于連鎖不平衡狀態(tài)（D′＝0.88，P＜0.05）。

3 討論

ABCB1是具有膜外泵功能的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛參與藥物的藥代動(dòng)力學(xué)。ABCB1 基因位點(diǎn)的突變可直接影響長(zhǎng)春新堿在體內(nèi)代謝的過(guò)程，進(jìn)而影響化療效果［9］。劉珊［10］研究發(fā)現(xiàn)，ABCB1 位點(diǎn)發(fā)生C／T突變降低了長(zhǎng)春新堿化療對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的療效。然而，ABCB1 rs10276036 位點(diǎn)多態(tài)性在尤文肉瘤化療耐藥性的作用國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。結(jié)合前期文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)熒光定量PCR 對(duì)尤文肉瘤患者ABCB1 rs10276036 位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C基因型突變可引起長(zhǎng)春新堿化療耐藥的增加，而CC 基因型更易出現(xiàn)化療耐藥。另有學(xué)者在肝細(xì)胞肝癌患者中也觀察到了CC基因型更易導(dǎo)致化療耐藥［11］。故而筆者推測(cè)C 基因型突變致使ABCB活性增強(qiáng)，造成藥物排出增多，進(jìn)而加速了藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程，最終導(dǎo)致有效血藥濃度下降引起敏感性下降。

探究影響肺部感染的因素對(duì)于改善患者的預(yù)后具有重要的意義。肺部感染患者多存在體內(nèi)炎癥反應(yīng)紊亂，研究炎癥調(diào)控相關(guān)基因的多態(tài)性是闡明肺部感染發(fā)生病理生理機(jī)制的切入點(diǎn)。結(jié)合前期研究和文獻(xiàn)報(bào)道，筆者對(duì)TLR4和IL-10基因多態(tài)性進(jìn)行了研究。TLR4 是一種跨膜的模式識(shí)別受體，病原體與其結(jié)合后激活免疫相關(guān)通路介導(dǎo)炎癥和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，其參與HIV感染、腸道病毒感染、HPV感染和支原體感染等多種感染的發(fā)病機(jī)制［12］。TLR4 rs11536889位點(diǎn)的多態(tài)性可影響機(jī)體炎癥水平，介導(dǎo)感染的發(fā)生。如周?chē)?guó)琴等［13］在血液透析患者中證實(shí)，TLR4 rs11536889 位點(diǎn)G 突變可引起導(dǎo)管相關(guān)性感染增多。本研究還發(fā)現(xiàn)TLR4 rs11536889位點(diǎn)GG基因型患者肺部感染發(fā)生率為50.94%，GC／CC 型為25.93%。與 GG 基因型相比，GC／CC型患者較少發(fā)生肺部感染。分析原因，筆者認(rèn)為G基因型突變引起TLR4 功能的變化，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)紊亂，使得免疫功能下降，最終導(dǎo)致肺部感染的增多。由于炎癥反應(yīng)調(diào)控復(fù)雜，筆者對(duì)涉及炎癥反應(yīng)另一關(guān)鍵分子IL-10進(jìn)行了研究，IL-10屬于TH1炎癥反應(yīng)抑制因子，主要由T 細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞分泌，廣泛參與微生物抗感染的過(guò)程。既往文獻(xiàn)報(bào)道IL-10 rs1554286 位點(diǎn)的多態(tài)性與維持性血液透析患者肺部感染具有顯著相關(guān)性［14］。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IL-10位點(diǎn)的突變也與肺結(jié)核的易感性密切相關(guān)［15］。但是其在腫瘤患者中并發(fā)肺感染的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)IL-10 rs1554286 位點(diǎn)GG 基因型患者肺部感染發(fā)生率為58.33%，GA／AA型為 28.13%。與 GG 基因型相比，GA／AA型患者較少發(fā)生肺部感染。本研究結(jié)果提示，IL-10基因多態(tài)性可能參與多種肺部感染的過(guò)程，并發(fā)揮重要的作用。

本研究存在以下不足之處：實(shí)驗(yàn)未排除性別和患病時(shí)間的差異，可能會(huì)造成選擇偏倚。其次，筆者未對(duì)肺部感染的病原體種類(lèi)未進(jìn)行具體分析，特定的基因多態(tài)性可能與不同病原體感染相關(guān)。綜上所述，ABCB1 rs10276036位點(diǎn)的多態(tài)性可影響尤文肉瘤患者的化療耐藥，C 等位基因突變可引起更差的化療效果；TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286位點(diǎn)的多態(tài)性則與尤文肉瘤患者并發(fā)肺部感染相關(guān)，G等位基因突變可增加肺部感染的可能。