尿液外泌體長(zhǎng)鏈非編碼 RNA MALAT1 和HIF1A-AS2對(duì)膀胱癌診斷的價(jià)值*

高娟，王青，王云杰，馬夢(mèng)影，王科勇，李卓（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710077）

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體（exosome）長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）作為潛在的腫瘤標(biāo)志物對(duì)癌癥的早期診斷及預(yù)后具有重要意義［1］。LncRNA人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis-as-sociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）在腎 癌［2］、肝 細(xì) 胞 癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）［3］等腫瘤中存在異常過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，并能作為細(xì)胞遷移相關(guān)基因、周期調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。缺氧誘導(dǎo)因子1α 反義 RNA2（hypoxia-inducible factor 1 alpha antisense RNA 2，HIF1A-AS2）是目前研究較多的一種與腫瘤密切相關(guān)的RNA，這類(lèi)基因沉默后可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。目前，LncRNA MALAT1和HIF1A-AS2在膀胱癌中的作用機(jī)制及調(diào)控機(jī)理受到越來(lái)越多的關(guān)注，由于膀胱癌患者尿液的易得性，尿液中獲取新型診斷標(biāo)志物具有良好的應(yīng)用前景。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)尿液外泌體中LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 的表達(dá)水平，旨在探討該兩項(xiàng)指標(biāo)在診斷膀胱癌中的臨床價(jià)值和意義。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年1月至2020年12月于西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿科就診的膀胱癌患者40例，其中男性35例，女性5 例，年齡40 ～78歲，中位年齡59歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）各研究對(duì)象均經(jīng)手術(shù)病理或膀胱鏡活檢確診［5］；（2）無(wú)放、化療等抗癌治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他心、肺、肝、腎臟功能不全者；（2）合并有心臟病、糖尿病、高血壓、精神障礙、器官衰竭、免疫疾病和創(chuàng)傷性疾病的患者；（3）合并其他系統(tǒng)腫瘤者。腫瘤分級(jí)，TNM分期采用WHO 分期標(biāo)準(zhǔn)［5］。同期收集泌尿科就診的膀胱良性疾病組患者40 例，其中男性30 例，女性10例，年齡30 ～80 歲，中位年齡55 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)泌尿科醫(yī)師臨床確診；（2）患有膀胱炎癥、膀胱結(jié)核、膀胱血管破裂、膀胱息肉、膀胱肌肉收縮無(wú)力等膀胱良性疾病的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他心、肺、肝、腎臟功能不全者；（2）合并有心臟病、糖尿病、高血壓、精神障礙、器官衰竭、免疫疾病和創(chuàng)傷性疾病的患者；（3）合并其他腫瘤者。同期收集體檢中心體檢健康者40例作為健康人對(duì)照組，其中男性 32 例，女性 8 例，年齡38～70歲，中位年齡54 歲。

1.2 試劑與儀器 外泌體RNA 提取試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司），LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（江蘇麥莎生物科技公司）。Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾儀器公司）。

1.3 標(biāo)本收集 用無(wú)菌管收集上述膀胱癌患者、膀胱良性疾病患者和健康人的晨起清潔中段新鮮（1 h 以?xún)?nèi)）尿液 100 mL。3 000×g 離心 20 min，留取上清液置于－80 ℃保存。

1.4 方法

1.4.1 尿液外泌體 RNA 提取 按照外泌體 RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取尿液外泌體。步驟：樣本于4 ℃、10 000×g離心 2 次，每次 30 min，取上清液至新的Ep管中，加入0.5倍體積的PBS稀釋?zhuān)偌尤?.05倍體積蛋白酶K溶液，37 ℃溫育15 min；然后加入0.3 倍總體積的外泌體分離試劑，4 ℃溫育2 h，10 000×g離心20 min，取沉淀即為外泌體。

1.4.2 western blot 法鑒定特異性標(biāo)志蛋白 CD63和CD81 提取外泌體和對(duì)照（PBS）組總蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，采用50 g／L 脫脂奶粉封閉 2 h，分別加入 CD63 和CD81 抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃溫育過(guò)夜；分別加入 HRP 標(biāo)記的 IgG（1 ∶2 000 稀釋?zhuān)?7 ℃溫育 1 h；采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色，Quantity one 軟件定量，以CD63／β-actin表示CD63 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以CD81／β-actin表示CD81 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 ELISA 法檢測(cè)尿液外泌體 LncRNA MALAT1和 HIF1A-AS2 水平 按 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用Multiskan FC型酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度（A 值），以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。MALAT1 和HIF1A-AS2的參考范圍均為：31.25～1 000 pg／mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，多個(gè)獨(dú)立樣本比較采用 Kruskal wallis H檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本兩兩比較采用Nemenyi法檢驗(yàn)。評(píng)估尿液外泌體 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2的最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)（cut-off 值），以敏感性為縱坐標(biāo)，以1－特異性為橫坐標(biāo)，繪制ROC 曲線。評(píng)估LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌尿液外泌體特異性標(biāo)志蛋白CD63 和CD81的鑒定 western blot 鑒定結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組尿液外泌體均特異性表達(dá)標(biāo)志蛋白CD63和CD81，且符合外泌體的分子特征，見(jiàn)圖1。

圖1 western blot 法鑒定膀胱癌患者尿液外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)志物CD63和CD81

2.2 各組尿液 外 泌體 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2的測(cè)定結(jié)果分析 結(jié)果顯示，膀胱癌組、膀胱良性疾病組和健康人對(duì)照組MALAT1的表達(dá)量 依 次 為 461.29 （400.33，504.64）、399.60（356.85，429.94）和 385.43（354.51，416.75），3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H ＝ 20.750，P ＜ 0.05）；HIF1A-AS2在上述3組中的表達(dá)水平依次為374.30（331.15，405.46）、340.04（256.41，364.85）和 291.71（256.56，348.34），3 組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H ＝22.540，P＜0.05）。

2.3 膀胱癌不同分級(jí)、不同分期及不同腫瘤大小尿液外泌體 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2 水平比較 根據(jù)腫瘤不同分級(jí)比較發(fā)現(xiàn)，膀胱癌 G1 級(jí)組尿液外泌體 LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 水平與 G2-G3 級(jí)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。根據(jù)膀胱癌不同分期的比較發(fā)現(xiàn)，Ta 期、T1～T2 期和 T3 ～T4 期 3 組之間尿液外泌體MALAT1和HIF1A-AS2 水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而腫瘤直徑≥3.0 cm 組患者尿液外泌體MALAT1 和 HIF1A-AS2 水平明顯高于直徑＜3.0 cm組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 不同分級(jí)、分期及腫瘤大小膀胱癌患者尿液外泌體LncRNA MALAT1和HIF1A-AS2水平比較

2.4 尿液外泌體 LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2水平對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值 以膀胱癌為疾病組，膀胱良性疾病及健康人為對(duì)照組，ROC曲線評(píng)估各項(xiàng)指標(biāo)診斷膀胱癌的效能，結(jié)果表明，MALAT1 診斷膀胱癌的ROC 曲線下面積（AUCROC）為0.748，敏感性為 75.0%，特異性為 66.25%；HIF1A-AS2 診斷膀胱癌的 AUCROC為 0.757，敏感性為75.0%，特異性為68.75%；MALAT1 和 HIF1A-AS2 聯(lián)合檢測(cè)診斷膀胱癌的 AUCROC為 0.820，敏感性為85.0%，特異性為81.25%，均高于兩項(xiàng)指標(biāo)的單獨(dú)診斷價(jià)值，見(jiàn)表2、圖2。

圖2 尿液外泌體 lncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2 診斷膀胱癌的ROC曲線

表2 尿液外泌體LncRNA MALAT1和HIF1A-AS2診斷膀胱癌的效能評(píng)價(jià)

3 討論

MALAT1 是一種普遍表達(dá)且高度保守的LncRNA，有學(xué)者報(bào)道，在腫瘤發(fā)生時(shí)細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER）的現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞核信號(hào) 1 的表達(dá)，激活 ER 激酶信號(hào)通路，促進(jìn)MALAT1 的表達(dá)［6］。研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào) MALAT1 可促進(jìn)miR-146b-5p表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞EMT和合成MMP-2，進(jìn)而發(fā)揮抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移的作用［7］。并且MALAT1 高表達(dá)與腫瘤患者的不良生存預(yù)后有關(guān)，可能成為新的腫瘤診斷、治療靶點(diǎn)［2-3］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組尿液外泌體中MALAT1的表達(dá)水平均明顯高于膀胱良性疾病組和健康人對(duì)照組；且與腫瘤的直徑大小密切相關(guān)，提示MALAT1可能成為診斷膀胱癌的新的生物學(xué)標(biāo)志物。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，HIF1A-AS2在多種癌癥中均呈異常表達(dá)，如在膀胱癌中靶向反義長(zhǎng)鏈非編碼RNA HIF1A-AS2可抑制膀胱癌的惡性表型［8］。乳腺癌中HIF1A-AS2 表達(dá)異常，可通過(guò)靶向miR-548c-3p抑制HIF-1／VEGF 通路，抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進(jìn)其體外凋亡過(guò)程，并與臨床病理及預(yù)后密切相關(guān)，具有作為腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物的潛質(zhì)［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尿液外泌體中HIF1A-AS2 的表達(dá)水平在膀胱癌組均明顯高于膀胱良性疾病組和健康人對(duì)照組；且與腫瘤的直徑大小密切相關(guān)，提示HIF1A-AS2在腫瘤中發(fā)揮促癌基因作用，參與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程。表明HIF1A-AS2可能成為診斷膀胱癌的重要生物學(xué)標(biāo)志物。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MALAT1診斷膀胱癌的敏感性為75.0%，特異性為 66.25%；HIF1A-AS2診斷膀胱癌的敏感性為 75.0%，特異性為 68.75%；而MALAT1 和 HIF1A-AS2 聯(lián)合檢測(cè)的敏感性為85.0%，特異性為 81.25%，均高于兩項(xiàng)指標(biāo)的單獨(dú)篩查價(jià)值，表明尿液外泌體MALAT1和HIF1A-AS2聯(lián)合檢測(cè)具有更高的膀胱癌的診斷價(jià)值，有望成為膀胱癌診斷、精準(zhǔn)治療及療效監(jiān)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物。后續(xù)研究中，筆者將進(jìn)一步選擇更接近臨床實(shí)際工作的樣本，驗(yàn)證尿液中的血紅蛋白、膽紅素、清蛋白及尿酸等對(duì)尿液MALAT1 和HIF1A-AS2 檢測(cè)的影響程度，并通過(guò)選擇不同的腫瘤標(biāo)志物與尿液MALAT1和HIF1A-AS2聯(lián)合檢測(cè)，以提高對(duì)膀胱癌診斷的準(zhǔn)確性［10］。