利用人多能干細(xì)胞來源的神經(jīng)管模型探究丙戊酸鈉的致畸機(jī)制*

張小佐，霍海芹，王艷，馮浩洋，林穎，許爭峰（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院＆南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京 210001）

神經(jīng)管畸形，又稱神經(jīng)管缺陷（neural tube de-fects，NTDs），是最常見的先天性畸形之一，主要表現(xiàn)類型有脊柱裂和無腦畸形等［1］。研究表明，NTDs是環(huán)境因素和遺傳因素交互作用所致，其中與NTDs發(fā)生相關(guān)的環(huán)境因素主要包括服藥史、糖尿病、感染和放射線等［2］。丙戊酸鈉（valproic acid，VPA）是一線抗癲癇藥物，然而一項(xiàng)人群數(shù)據(jù)研究提示，孕期服用VPA可增加胎兒患NTDs的風(fēng)險(xiǎn)［3］，這使得VPA 在妊娠期的使用陷入兩難的境地［4］。目前關(guān)于NTDs 的研究主要以動物模型為主［5-6］，且在上述動物研究中已證實(shí)VPA 具有神經(jīng)致畸性［7］，但該研究存在一定的局限性，因?yàn)槟Ｊ絼游锱c人類的大腦發(fā)育存在遺傳學(xué)背景差異。

人多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）是一類具有自我更新能力的多潛能細(xì)胞［8］。本研究通過懸浮培養(yǎng)hPSCs并提供3D培養(yǎng)環(huán)境以改善體外神經(jīng)誘導(dǎo)的條件，分化獲得具有單個lumen的玫瑰花環(huán)樣組織，與體內(nèi)神經(jīng)管相似。在該模型的基礎(chǔ)上，筆者在體外分化培養(yǎng)體系中加入VPA，通過比較VPA加藥組與對照組之間的差異，以期進(jìn)一步探討VPA導(dǎo)致NTDs的可能發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑與儀器 人多能干細(xì)胞系RC01001-B（安徽中盛溯源公司）。hPSCs 培養(yǎng)基（北京賽貝公司），Matrigel 基底膜基質(zhì)（美國康寧公司），DMEM／F12 培養(yǎng)基、非必需氨基酸 NEAA、N2、B27、TrypLE、F-actin 染料、山羊抗小鼠 488 熒光二抗、山羊抗兔546 熒光二抗（美國 Thermo 公司），ROCK 抑制劑 Y-27632632（美國 Stem cell 公司），丙戊酸鈉（美國 Sigma 公司），驢血清（美國Millipore 公司），兔抗人 OCT4 單克隆抗體（英國Abcam公司），小鼠抗人OCT4 單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人PAX6 多克隆抗體、小鼠抗人NCAD 單克隆抗體（美國Biolegend 公司），兔抗人ECAD單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），小鼠抗人PKCλ單克隆抗體（美國BD公司），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR 試劑盒（南京諾唯贊公司）。熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司），NanoDrop 紫外分光光度計(jì)（美國Thermo公司）。

1.2 hPSCs的培養(yǎng)與傳代 取上述培養(yǎng)的hPSCs，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時，使用1 mL TrypLE（1×）進(jìn)行消化，終止消化后加入hPSCs 培養(yǎng)基，接種于Matrigel鋪底的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每日換液。傳代至20代后用于神經(jīng)誘導(dǎo)分化。

1.3 神經(jīng)誘導(dǎo)分化 取上述經(jīng)消化培養(yǎng)的hPSCs，加入 NIM 培養(yǎng)基［N2（1 ∶100 稀釋）＋NEAA（1 ∶100稀釋）＋DMEM／F12］重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。每日換液，培養(yǎng)瓶傾斜靜置，待細(xì)胞團(tuán)沉降后，棄去上層培養(yǎng)基，加入 NIM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞團(tuán)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。通過免疫熒光染色試驗(yàn)檢測hPSCs向神經(jīng)方向分化的指標(biāo)，包括多能性標(biāo)志物 Oct-4，神經(jīng)特性標(biāo)志物 PAX6，ECAD，NCAD，F(xiàn)-actin和 PKCλ等的表達(dá)，以驗(yàn)證體外神經(jīng)管模型。在此基礎(chǔ)上，從分化第0 天起在培養(yǎng)體系中加入不同濃度 VPA：0（對照組）、0.1、1 和10 μmol／L進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，每組重復(fù)3次。

1.4 免疫熒光染色試驗(yàn) 取上述細(xì)胞，用PBS 洗滌1次，4%多聚甲醛固定4 h 后蔗糖脫水，包被后進(jìn)行冰凍切片。PBS 洗滌3 次，10%驢血清＋0.2%Triton室溫封閉1 h。分別加入兔抗人OCT4 單克隆抗體，兔抗人PAX6 多克隆抗體，兔抗人ECAD單克隆抗體，小鼠抗人OCT4 單克隆抗體，小鼠抗人NCAD單克隆抗體，小鼠抗人PKCλ單克隆抗體（均為 1 ∶500 稀釋）4 ℃ 過夜。PBS 洗滌 4 次，加入相應(yīng)的山羊抗兔546熒光二抗，山羊抗小鼠488 熒光二抗和細(xì)胞骨架染料 F-actin（1 ∶1 000 稀釋），室溫避光靜置1 h。PBS 洗滌4 次，抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR） 用 Trizol 法提取分化第4天細(xì)胞（約1×106個）的RNA樣本。采用Nano-Drop紫外分光光度計(jì)檢測RNA 濃度，選擇RNA 濃度大于 100 ng／μL，吸光度（A260nm／A280nm）值＞2.0 的RNA樣本，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于－80 ℃保存。

1.6 引物設(shè)計(jì)及實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物由南京諾唯贊生物科技公司設(shè)計(jì)并合成。GAPDH（GenBank 序列號：NM＿001256799）上游引物序列：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序 列：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，退火溫度61 ℃，產(chǎn)物片段大小為197 bp。OCT4（GenBank 序列號：Z11898）上游引物序列：5′-CTGG GTTGATCCTCGGACCT-3′，下游引物序列：5′-CCAT CGGAGTTGCTCTCCA-3′，退火溫度 61 ℃，產(chǎn)物片段大小為243 bp。PAX6（GenBank序列號NM＿001604）上游引物序列：5′-TGGGCAGGTATTACGAGACTG-3′，下游引物序列：5′-ACTCCCGCTTATACTGGGCTA-3′，退火溫度62 ℃，產(chǎn)物片段大小為111 bp。以GAPDH作為內(nèi)參。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括：ChamQ SYBR qPCR Master Mixure 10 μL，10 μmol／L上、下游引物各 0.4 μL，RNase-free H2O 8.2 μL，cDNA 樣本 1 μL。采用 Step one plus 實(shí)時熒光定量PCR儀檢測，PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。使用7500熒光定量PCR系統(tǒng)分析軟件采集熒光信號并進(jìn)行熔解曲線分析，各基因的相對表達(dá)水平以2－ΔΔCt法計(jì)算，公式：ΔΔCt＝［（實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因－實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因）－（對照組Ct目的基因－對照組Ct內(nèi)參基因）］。每組設(shè)2個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism7 軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外神經(jīng)管模型的驗(yàn)證

2.1.1 體外神經(jīng)管模型的建立 鏡下可見hPSCs呈貼壁生長，細(xì)胞克隆邊界清晰；分化第0天hPSCs呈單細(xì)胞懸浮狀態(tài)；分化第2天懸浮培養(yǎng)的hPSCs形成細(xì)胞聚集體（擬胚體）；擬胚體在第4天發(fā)育為含有中央空腔的三維結(jié)構(gòu)體，即玫瑰花環(huán)樣組織（圖1A）。

2.1.2 多能性向神經(jīng)特性的細(xì)胞命運(yùn)特化 免疫熒光染色結(jié)果顯示，擬胚體中絕大部分細(xì)胞OCT4表達(dá)呈陽性；玫瑰花環(huán)樣組織中OCT4＋細(xì)胞明顯減少；分化第6天幾乎沒有細(xì)胞表達(dá)OCT4（圖1B）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，OCT4 在分化第 2、4、6 天的相對表達(dá)量分別為 0.89±0.07、0.75±0.08 和 0.38±0.13，且分化第2天與第6 天相對表達(dá)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)分化過程中 OCT4 表達(dá)逐漸減少（圖1C）。擬胚體PAX6 表達(dá)呈陰性；玫瑰花環(huán)樣組織中大部分細(xì)胞PAX6 表達(dá)呈陽性；分化第6 天PAX6 表達(dá)陽性的細(xì)胞增多（圖1D）。qRT-PCR結(jié)果顯示，分化過程中PAX6表達(dá)逐漸增加（圖1E）。

圖1 多能性向神經(jīng)特性的細(xì)胞命運(yùn)特化

2.1.3 細(xì)胞命運(yùn)特化中鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)變 免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬胚體中ECAD主要表達(dá)于細(xì)胞表面；玫瑰花環(huán)樣組織中ECAD表達(dá)陽性區(qū)域減少（圖2A）。擬胚體中NCAD 表達(dá)呈陰性；玫瑰花環(huán)樣組織中NCAD集中表達(dá)于細(xì)胞的頂部區(qū)域，在組織中央形成閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖2B）。OCT4 與ECAD共同染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬胚體中 ECAD 與OCT4表達(dá)均呈陽性（圖2C），玫瑰花環(huán)樣組織中NCAD與PAX6均呈陽性表達(dá)（圖2D）。

圖2 分化過程中鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)變

2.1.4 lumen 的形成結(jié)果 免疫熒光染色結(jié)果顯示，玫瑰花環(huán)樣組織中F-actin 主要表達(dá)于細(xì)胞的頂部區(qū)域，在組織中央形成神經(jīng)管樣的空腔結(jié)構(gòu)（圖3A）。F-actin熒光強(qiáng)度曲線圖呈雙峰狀，雙峰間的低信號區(qū)域即為lumen（圖3B）。玫瑰花環(huán)樣組織中PKCλ主要分布在組織的頂部，形成神經(jīng)管樣的極化環(huán)（圖3C）。

圖3 lumen的形成示意圖

2.2 VPA對體外神經(jīng)管的致畸性

2.2.1 VPA的濃度篩選 體外神經(jīng)管的直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對照組、VPA 0.1 μmol／L、VPA 1 μmol／L和 VPA 10 μmol／L 組的 直 徑 分 別 為 （90.81 ±0.88）μm、（87.14±1.35）μm、（77.19±1.34）μm 和（75.63±0.86）μm（圖 4A）。VPA 10 μmol／L 組以及VPA 1 μmol／L組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）；而 VPA 0.1 μmol／L 組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.050）。

2.2.2 VPA 對 lumen 形成的影響 VPA 濃度篩選結(jié)果顯示，VPA 1 μmol／L為最低的致畸濃度，故而選擇此濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，VPA 1 μmol／L 組中 F-actin 表達(dá)呈雜亂分布的狀態(tài)，未能在神經(jīng)管內(nèi)的頂部區(qū)域聚集形成lumen（圖 4B）。VPA 1 μmol／L 組中 F-actin 的熒光強(qiáng)度曲線與對照組的雙峰形狀不同（圖4C），無明顯低谷樣的低信號區(qū)域（圖4D）。對照組中PKCλ集中分布于神經(jīng)管的中央部位形成極化環(huán)，與對照組相比，VPA 1 μmol／L 組中 PKCλ 呈現(xiàn)散亂分布的狀態(tài)，其中央的空腔結(jié)構(gòu)失去頂部極性（圖4E）。

圖4 VPA對體外神經(jīng)管的影響

3 討論

近年來，隨著hPSCs被廣泛應(yīng)用于人類胚胎發(fā)育學(xué)的研究［9-10］，有學(xué)者已成功誘導(dǎo)獲得具有l(wèi)umen的玫瑰花環(huán)樣組織，也稱類神經(jīng)管結(jié)構(gòu)［11］，表現(xiàn)為多個玫瑰花環(huán)樣組織的聚集狀態(tài)。本研究通過改變體外神經(jīng)誘導(dǎo)的條件，發(fā)現(xiàn)多能性標(biāo)志物OCT4表達(dá)減少與神經(jīng)特性標(biāo)志物PAX6 表達(dá)增加，表明hPSCs在體外分化過程中逐漸喪失多能性，特化為具有神經(jīng)特性的玫瑰花環(huán)樣組織。ECAD與NCAD在分化不同階段表達(dá)模式的改變說明細(xì)胞命運(yùn)特化的過程中存在鈣黏蛋白表達(dá)的時空轉(zhuǎn)變。細(xì)胞骨架標(biāo)志物F-actin 與極性標(biāo)志物PKCλ 在組織頂部區(qū)域的聚集表達(dá)標(biāo)志著重要結(jié)構(gòu)lumen 的形成。因此，筆者利用hPSCs分化獲得的具有單個lumen的體外神經(jīng)管模型不僅在細(xì)胞命運(yùn)和形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面可模擬體內(nèi)的神經(jīng)管發(fā)育過程，同時避免了傳統(tǒng)類神經(jīng)管結(jié)構(gòu)中多個玫瑰花環(huán)樣組織聚集狀態(tài)帶來的局限性，與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)由體內(nèi)單個神經(jīng)管發(fā)育而來的過程更為相似。另外，改善后的體外神經(jīng)誘導(dǎo)的方法與過程更為簡易，是探索VPA導(dǎo)致NTDs的疾病發(fā)生機(jī)制的有效實(shí)驗(yàn)平臺。

本研究證實(shí)，隨著分化體系中VPA 濃度的增加，體外神經(jīng)管的直徑逐漸減小，表明VPA 對體外神經(jīng)管具有生長抑制作用，且呈劑量依賴性。另外，VPA 1 μmol／L 組中 F-actin 以及 PKCλ 的表達(dá)均呈現(xiàn)雜亂分布，未聚集在細(xì)胞的頂部區(qū)域，導(dǎo)致無法形成具有頂部極性的lumen，這說明VPA通過影響分化過程中關(guān)鍵的細(xì)胞骨架功能和改變細(xì)胞的極化過程，誘發(fā)體外神經(jīng)管分化失敗。已有研究表明，神經(jīng)管畸形的重要發(fā)生機(jī)制之一為平面細(xì)胞極性信號通路（planner cell polarity pathway，PCP），該信號通路可控制細(xì)胞的極性運(yùn)動，并且與細(xì)胞骨架功能緊密相關(guān)［12-13］。因此，筆者推測 VPA 通過影響PCP 通路，改變細(xì)胞極性從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組，這是VPA導(dǎo)致NTDs的潛在疾病發(fā)生機(jī)制。

綜上所述，本研究利用hPSCs成功建立了體外神經(jīng)管模型，該模型可在細(xì)胞命運(yùn)和形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面模擬體內(nèi)的神經(jīng)管發(fā)育過程，但在完整重現(xiàn)神經(jīng)管發(fā)育方面仍有許多局限性，本研究中的模型培養(yǎng)

周期較短，無法體現(xiàn)體內(nèi)神經(jīng)管繼續(xù)發(fā)育的過程。筆者發(fā)現(xiàn)VPA通過影響分化過程中的細(xì)胞骨架功能與細(xì)胞極性破壞體外神經(jīng)管中l(wèi)umen 的形成，并推測PCP 信號通路可能是VPA增加神經(jīng)管畸形發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的潛在致畸機(jī)制，為進(jìn)一步探索VPA 導(dǎo)致NTDs的發(fā)生機(jī)制提供了思路，但其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。