人參皂苷Rg1對(duì)順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制

顏倩，石丹寧，楊佳迪，何悅雙，趙丕文（北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488）

近年來，由于環(huán)境污染及生活、工作壓力的日益增加，卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）及其導(dǎo)致的生殖功能障礙發(fā)生率明顯上升，引起了大家的普遍關(guān)注[1]。POF 是指在女性40 歲以前出現(xiàn)卵巢功能衰退的現(xiàn)象，其發(fā)病率約1%[2]。臨床特征表現(xiàn)為閉經(jīng)，伴隨高促卵泡激素（FSH）和低雌激素水平[3]等。

目前POF 的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。臨床上，對(duì)POF 患者常采取的治療方法是雌激素替代療法[4]，雖然可明顯緩解癥狀，但由于激素治療所帶來的致癌等不良反應(yīng)及高復(fù)發(fā)率等問題，使患者對(duì)激素治療的依從性普遍較低，在臨床應(yīng)用中受到一定限制。因此，尋找具有療效確鑿且不良反應(yīng)小的抗POF 藥物并揭示其分子機(jī)制具有重要的理論和臨床意義。有研究者發(fā)現(xiàn)，人參主要活性成分人參皂苷Rg1能明顯改善POF 的癥狀和體征[5]，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚待闡明。近年來研究發(fā)現(xiàn)FSH 受體（FSHR）可介導(dǎo)激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，如PI3K/AKT 通路，影響生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[6]。PI3K/AKT 通路與POF 發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，通過激活該通路，可顯著抑制細(xì)胞的增殖與凋亡[7]。此外，本課題組前期研究中已利用順鉑體外誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞損傷，成功建立了POF 模型[8]。因此，本研究利用該模型深入探討人參皂苷Rg1對(duì)FSHR/PI3K/AKT 通路的調(diào)控作用，揭示人參皂苷Rg1對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞保護(hù)作用的可能分子機(jī)制，為人參皂苷Rg1應(yīng)用于POF 臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雌性SD 大鼠16 只，22 ～24 d，體質(zhì)量為（55±2）g（北京華阜康生物科技股份有限公司），飼養(yǎng)在溫度為（25±3）℃，濕度50%～60%，光照12 h，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。動(dòng)物使用許可證：SYXK [京] 2020-0033。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1（源葉生物，批號(hào)：RSZD-121106，純度≥98%），β-雌二醇（E2，批號(hào)：100182-201906，純度：96.3%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），順鉑（源葉生物，批號(hào)：B24462）。Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium/Ham’s F-12 50/50 Mix（DMEM/F12）（Cellgro 公司，貨號(hào)：10-092-CVR），HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒、Hoechst33258 試劑盒（北京索萊寶公司），抗體FSHR、PI3K、p-AKT、AKT、Bcl-2、Bax、β-actin、Coralite594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody（美國(guó)Proteintech），LY294002（Abcam，美國(guó)ab146593）。

2 方法

2.1 體外原代卵巢顆粒細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，每只注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）50 IU，48 h 后，無菌環(huán)境下提取雙側(cè)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。操作步驟如下：① 取SD 雌鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死，于75%乙醇中消毒3 min；② 將SD 雌鼠放入消毒托盤中取出雙側(cè)卵巢，并加入適量預(yù)冷PBS；③將卵巢表面的脂肪，包膜等處理干凈后，放入預(yù)冷PBS 的消毒托盤中清洗；④ 將卵巢移入無血清培養(yǎng)基中，并用1 mL 一次性注射器刺破卵巢邊緣的卵泡，使卵巢顆粒細(xì)胞充分釋放；⑤ 處理完畢后，將含有卵巢顆粒細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基移入EP 管，離心（半徑 8 cm，1000 r·min-1）10 min；⑥ 棄上清液，加入適量的PBS 沖散細(xì)胞，1000 r·min-1離心5 min；⑦ 再次棄上清液，加入一定量的含10% 胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基，并吹打均勻；⑧ 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以1×105個(gè)/孔接種于96 孔板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3 d 后換一次培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)至75%～80%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 卵巢顆粒細(xì)胞鑒定

2.2.1 HE 染色 將顆粒細(xì)胞接種于含爬片的24孔板，培養(yǎng)基體積為1 mL/孔，細(xì)胞數(shù)量1×106個(gè)/孔，按照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下：① 移除舊培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，每次5 min；② 在37 ℃下，用4%多聚甲醛先固定20 min，然后PBS 洗滌3 次，每次5 min；③蘇木素染色2 min，自來水沖洗2 min；④ 鹽酸乙醇分色2 s，快速取出并用自來水小心沖洗3 min；⑤ 醇溶性伊紅染色2 min，自來水沖洗；⑥ 無水乙醇脫水，并用二甲苯透明化處理。封片后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法 以 1×106個(gè)/孔的密度將顆粒細(xì)胞接種于含爬片的24 孔板中，使用免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定FSHR 表達(dá)量。具體操作如下：① 棄培養(yǎng)基后用PBS 洗滌3 次，每次2 min；②先用4%多聚甲醛于37℃下固定15 min，接著PBS 洗滌3 次，每次3 min；③ 每孔加0.5 mL5%BSA 室溫封閉1 h 后棄掉；④ 每孔加0.5 mL FSHR 一抗（1∶250），4 ℃過夜，次日PBS 洗滌3 次，每次10 min；⑤ 每孔加0.5 mL 相對(duì)應(yīng)的羊抗兔二抗（1∶200），室溫條件下，避光孵育1 h，PBS 洗滌3 次，每次10 min；⑥ 將含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑滴加于載玻片上，蓋上爬片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 CCK8 法

2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 不同質(zhì)量濃度人參皂苷Rg1（0 ～ 400 ng·mL-1）處理顆粒細(xì)胞24 h，用于研究人參皂苷Rg1對(duì)顆粒細(xì)胞的毒副作用，并根據(jù)結(jié)果選擇人參皂苷Rg1低、中、高濃度。不同質(zhì)量濃度順鉑（0 ～80 μg·mL-1）處理顆粒細(xì)胞12 h，用于建立POF 模型，并選出最佳造模濃度。然后，將細(xì)胞分為正常組、模型組、人參皂苷Rg1低（順鉑+低濃度人參皂苷Rg1）、中（順鉑+中濃度人參皂苷Rg1）、高濃度組（順鉑+高濃度人參皂苷Rg1）和E2 組（順鉑+β-雌二醇），并分別培養(yǎng)24、48 h，用于研究人參皂苷Rg1對(duì)順鉑作用下顆粒細(xì)胞的影響，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳人參皂苷Rg1的濃度。

2.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 以1×105個(gè)/孔將顆粒細(xì)胞接種于96 孔板，每組5 個(gè)復(fù)孔，藥物處理結(jié)束后，將含10% CCK8 無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中，100 μL/孔，并在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，于450 nm 處檢測(cè)吸光值。

2.4 Hoechst 33258 染色

按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞的分組與給藥，用4%多聚甲醛固定后加入Hoechst 33258 染色液反應(yīng)5 min。其他操作同“2.2.2”項(xiàng)下⑤⑥的步驟。

2.5 Western blot

使用預(yù)冷PBS 清洗細(xì)胞后，用含1% PMSF和1%磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。離心后吸取上清液，進(jìn)行BCA 蛋白定量。用12% SDS-PAGE 分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（100 V 75 min）。然后，室溫下封閉1.5 h，再將膜與一抗：FSHR 抗體（1∶1000）、PI3K 抗體（1∶1000）、Akt 抗體（1∶1000）、p-AKT抗體（1∶1000）、Bax 抗體（1∶1000）、Bcl-2 抗體（1∶1000）和β-actin 抗體（1∶5000）在4 ℃孵育過夜。用PBST 洗滌3 次，每次10 min 后，加入對(duì)應(yīng)的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。再用PBST 洗滌3 次，每次10 min，用BCL 發(fā)光底物后使用凝膠成像儀顯影，通過Image J 軟件統(tǒng)計(jì)條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用單因素方差分析檢驗(yàn)，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定

HE 染色結(jié)果顯示，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，體積較大，呈多角梭形，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，為深藍(lán)色，呈卵圓形或者不規(guī)則形；胞質(zhì)為淡紅色，染色均勻，邊緣清晰（見圖1）。免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示，卵巢顆粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物FSHR 在胞質(zhì)中大量表達(dá)，呈紅色，在核呈深藍(lán)色，結(jié)果表明分離到的細(xì)胞是卵巢顆粒細(xì)胞（見圖2）。

圖1 卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)（HE 染色，×200）Fig 1 Morphological of ovarian granulosa cells（HE staining，×200）

圖2 免疫熒光檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞FSHR 的表達(dá)（免疫熒光染色，×200）Fig 2 Expression of FSHR in ovarian granulosa cells detected by immunofluorescence（immunofluorescence staining，×200）

3.2 人參皂苷Rg1 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響

應(yīng)用0、12.5、25、50、100、200、300、400 ng·mL-1的人參皂苷Rg1作用于顆粒細(xì)胞后，細(xì)胞存活率分別為100%、100.94%、100.03%、101.28%、99.86%、100.02%、100.74%、101.78%，表明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，人參皂苷Rg1并未對(duì)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用（見圖3A）。人參皂苷Rg1在100、200、300 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞的存活率較為穩(wěn)定。所以本實(shí)驗(yàn)選取100、200、300 ng·mL-1分別作為人參皂苷Rg1低、中、高濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 順鉑誘導(dǎo)的POF 模型建立

如圖3B 所示，與正常組相比，順鉑作用于顆粒細(xì)胞12 h 后，細(xì)胞的存活率隨著順鉑質(zhì)量濃度的增加而下降?；陧樸K處理卵巢顆粒細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），選取40 μg·mL-1順鉑處理細(xì)胞12 h 作為后續(xù)POF 模型建立的條件。

3.4 人參皂苷Rg1 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的保護(hù)作用

如圖3C 所示，40 μg·mL-1順鉑處理12 h 后，再使用低濃度、中濃度和高濃度人參皂苷Rg1處理后，其存活率隨著人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度的增加顯著提高，且高質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用最為明顯。以上結(jié)果表明，人參皂苷Rg1可保護(hù)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，在高質(zhì)量濃度時(shí)作用效果最佳。因此，選取高質(zhì)量濃度人參皂苷Rg1用于完成后續(xù)分子機(jī)制的研究。

圖3 人參皂苷Rg1 對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effect of ginsenoside Rg1 on granulosa cell proliferation

3.5 人參皂苷Rg1 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響

與正常組相比，模型組胞核呈亮藍(lán)色熒光，并出現(xiàn)固縮與破碎現(xiàn)象；與模型組相比，高質(zhì)量濃度人參皂苷Rg1組和E2 組胞核熒光強(qiáng)度降低，且核固縮與破碎現(xiàn)象顯著減少（見圖4）。

圖4 人參皂苷Rg1 對(duì)順鉑損傷的顆粒細(xì)胞凋亡的影響（Hoechst 33258 染色，×200）Fig 4 Effect of ginsenosid Rg1 on the apoptosis of cisplatin-injured granulosa cells（Hoechst 33258 staining，×200）

3.6 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的變化

與正常組相比，模型組中FSHR、PI3K、p-AKT/AKT 和Bcl-2 蛋白表達(dá)均顯著減少，Bax 蛋白表達(dá)均增加；與模型組相比，人參皂苷Rg1高濃度組和E2 組中FSHR、PI3K、p-AKT/AKT 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均表達(dá)增加，Bax 的表達(dá)減少（見圖5及圖6）；與人參皂苷Rg1高濃度組和E2組相比，人參皂苷Rg1高濃度+抑制劑組和E2+抑制劑組中Bcl-2 蛋白表達(dá)均明顯減少（見圖7）。

圖5 人參皂苷Rg1 對(duì)順鉑損傷的顆粒細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 表達(dá)的影響Fig 5 Effect of ginsenosid Rg1 on Bax and Bcl-2 expression in cisplatin-injured granulosa cells

圖6 人參皂苷Rg1 對(duì)順鉑損傷的顆粒細(xì)胞內(nèi)FSHR/PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effect of ginsenosid Rg1 on the expression of key proteins in FSHR/PI3K/AKT signaling pathway in cisplatin-injured granulosa cells

圖7 PI3K 抑制劑對(duì)順鉑損傷的顆粒細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Effect of PI3K inhibitor on the expression of Bcl-2 protein in cisplatin-injur granulosa cells

4 討論

POF 是一種由遺傳和免疫等原因引起的發(fā)生于40 歲以下女性的內(nèi)分泌紊亂性疾病[9]，伴有多組織、器官功能障礙，如心血管、骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生，甚至促使患者提前衰老，影響其壽命[10-11]。臨床上激素替代療法雖能明顯改善患者的癥狀與體征，但也增加了子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和靜脈栓塞性疾病等發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[12]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可顯著提高卵巢組織的抗衰老能力和POF 小鼠的生育能力[13-14]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，通過激活PI3K/AKT 通路與抑制顆粒細(xì)胞凋亡可改善POF，保護(hù)卵巢功能[8，15]。因此，本研究從體外提取原代卵巢顆粒細(xì)胞，探討人參皂苷Rg1是否通過調(diào)控FSHR/PI3K/AKT 途徑發(fā)揮抗POF 作用。

順鉑是臨床一線常用化療藥物，其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明確的殺傷作用，但其對(duì)正常組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能也有損傷，研究表明，順鉑可導(dǎo)致POF[16]。另外，在順鉑誘導(dǎo)的POF 大鼠模型中，血清FSH 顯著升高，且其卵巢組織衰退性改變與化療藥應(yīng)用于人體導(dǎo)致的POF 病變過程很相似[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用順鉑誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞損傷來建立POF 模型。

FSH 是哺乳動(dòng)物生殖與發(fā)育的重要激素，可促進(jìn)卵泡的發(fā)育、卵母細(xì)胞的成熟和性類固醇激素的合成[18]。POF 患者檢查結(jié)果主要顯示為血清FSH值增高和卵泡發(fā)育不成熟，其原因可能是卵巢組織上FSH 受體（FSHR）的功能減弱或受損，導(dǎo)致對(duì)FSH 刺激不敏感，從而抑制卵泡的發(fā)育[19]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可顯著增強(qiáng)細(xì)胞中FSHR 表達(dá)，即人參皂苷Rg1可通過上調(diào)FSHR 的表達(dá)，促進(jìn)對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。

FSH 與靶細(xì)胞表面FSHR 結(jié)合后，可激活PI3K/AKT 信號(hào)通路[20]，促進(jìn)生殖系統(tǒng)的發(fā)育與成熟。在D-半乳糖誘導(dǎo)的POF 模型中，姜黃素可通過激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，有效抑制顆粒細(xì)胞凋亡和卵巢損傷[21]。在環(huán)磷酰胺和白消安誘導(dǎo)的小鼠POF 模型中，胚胎干細(xì)胞來源細(xì)胞外小囊泡可以通過激活PI3K/AKT 通路，明顯提高血清性激素水平，增加卵泡數(shù)量和減少凋亡細(xì)胞數(shù)量[22]。Wang 等[23]研究表明，針刺百會(huì)、關(guān)元和太沖等可通過上調(diào)PI3K/AKT 通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，抑制顆粒細(xì)胞凋亡和改善卵泡的發(fā)育，從而減輕環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可明顯提高PI3K 和p-AKT 的蛋白表達(dá)，提示人參皂苷Rg1可通過上調(diào)FSHR 蛋白的表達(dá)，激活下游PI3K/AKT 途徑中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。

PI3K/AKT 通路不但是影響POF 的重要途徑，還是影響細(xì)胞凋亡的重要途徑。在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2 和Bax 兩種調(diào)控因子通過形成同/異源二聚體的形式發(fā)揮重要作用。Bcl-2和Bax 兩者互為拮抗作用，當(dāng)Bax 蛋白水平表達(dá)上調(diào)時(shí)，Bax 可與Bax 結(jié)合形成同源二聚體，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。反之當(dāng)Bcl-2 水平上調(diào)時(shí)，Bcl-2 可與Bax 形成異源二聚體，抑制顆粒細(xì)胞凋亡[24-25]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可顯著增強(qiáng)Bcl-2 蛋白表達(dá)并降低Bax 表達(dá)，而加入PI3K 抑制劑后，Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低，即人參皂苷Rg1可通過激活FSHR/PI3K/AKT 途徑，抑制顆粒細(xì)胞凋亡，保護(hù)卵巢的功能。

綜上所述，人參皂苷Rg1可能通過激活FSHR/PI3K/AKT 信號(hào)通路，抑制順鉑損傷的顆粒細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)卵巢顆粒細(xì)胞免受損傷。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果或?yàn)樯钊肓私庵兴幦藚⒌乃幚碜饔脵C(jī)制和Rg1的進(jìn)一步研究提供參考。