黃精對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠藥效作用初步研究

聊曉玉，方靜，方媛，桂文琪，孫紀(jì)，韓燕全，韓嵐*，吳存林，龍子江，孫松（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230000；2. 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230000；3. 安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230000；4. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥 230012；5. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230093；. 合肥仟金草生物科技有限公司，合肥 230093；. 安徽仟金草黃精規(guī)劃院，合肥 230093；8. 合肥遠(yuǎn)志醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司，合肥 230093）

痛經(jīng)發(fā)生在月經(jīng)前后期或月經(jīng)期間，痛經(jīng)發(fā)生時(shí)小腹有疼痛、墜脹感，同時(shí)還伴有腰酸或其他疼痛。在臨床上，主要將痛經(jīng)分為兩種，一種是原發(fā)性痛經(jīng)，另外一種是繼發(fā)性痛經(jīng)，在這兩者中原發(fā)性痛經(jīng)占90%以上。對(duì)廣大女性朋友來(lái)說(shuō)，痛經(jīng)不僅僅傷害了她們的身心健康，還給她們的工作及學(xué)習(xí)帶來(lái)了嚴(yán)重的困擾，因而預(yù)防和治療原發(fā)性痛經(jīng)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的問(wèn)題。大多數(shù)研究者認(rèn)為原發(fā)性痛經(jīng)的產(chǎn)生與前列腺素E2（PGE2）、前列腺素F2α（PGF2α）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）及其他因素有關(guān)[1-7]。PGF2α含量升高可引起子宮平滑肌過(guò)強(qiáng)收縮，血管痙攣，造成子宮缺血、乏氧而出現(xiàn)痛經(jīng)；PGE2則能抑制子宮平滑肌的自發(fā)活動(dòng)，降低PGF2α/PGE2比值可在一定程度上緩解疼痛。β-EP 水平降低可使子宮功能失常，成為疼痛的原因之一。前列腺環(huán)素（PGI2）有擴(kuò)張血管和抑制血小板聚集的作用，而6-keto-PGF1α作為PGI2 的代謝產(chǎn)物，性質(zhì)穩(wěn)定，可以反映PGI2 的含量。因此，本文選擇上述代表性生化指標(biāo)、組織病理指標(biāo)以及子宮肌張力對(duì)黃精藥效學(xué)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

黃精是我國(guó)常用傳統(tǒng)中藥之一，用藥歷史悠久，同時(shí)也是一種藥食同源的中藥材。具有補(bǔ)肝益腎、延年益壽等功效，被尊崇為養(yǎng)生之圣藥。黃精的記載始于梁朝陶弘景《名醫(yī)別錄》，并列于草部的首位。研究表明其具有抗炎[8-10]、鎮(zhèn)痛[11]、抗腫瘤[12-13]、調(diào)節(jié)血糖血脂[14-19]和抗衰老[20]等藥理作用?！侗窘?jīng)逢原》：“黃精，寬中益氣，使五藏調(diào)和，肌肉充盛，骨髓強(qiáng)堅(jiān)，皆是補(bǔ)陰之功?！币环N具有益腎調(diào)經(jīng)功能的組合物及其應(yīng)用的專利表明，該組合物可以用于治療因腎氣虛弱、血虧血滯導(dǎo)致的卵巢功能早衰、月經(jīng)不調(diào)以及原發(fā)性痛經(jīng)，其中黃精的補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤(rùn)肺益腎作用起到了很大的作用[21-25]。

基于黃精的“補(bǔ)陰之功”，從原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，為了能更好的挖掘黃精的藥用范圍，本文通過(guò)建立原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，初步探究黃精對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的治療作用。

1 材料

1.1 試藥

黃精（采自安徽省池州市青陽(yáng)縣酉華鎮(zhèn)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞年軍教授鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua. 的干燥根莖）；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)：492A）；縮宮素注射液（寧波第二激素廠，批號(hào)：201212）；婦科千金片（株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20191011）；樂(lè)氏液（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R20265）；大鼠PGF2α酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：JL13273）、大鼠PGE2酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：JL12636）、大鼠6-keto-PGF1α酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：JL11068）、大鼠β-EP 酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：JL20852）（上海江萊實(shí)業(yè)股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD 大鼠，雌性，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 [許可證號(hào)SCXK（皖）2017-001；本實(shí)驗(yàn)使用所有動(dòng)物均通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理編號(hào)：AHUCM-rats-2021024]。將購(gòu)買的大鼠在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。飼養(yǎng)期間，正常喂飼料、喂水，房間溫度為25℃，房間濕度為60%～65%。

1.3 儀器

恒溫平滑肌實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司，HW200S）；BL-420N 信號(hào)采集與分析系統(tǒng)、FT-102 生物張力傳感器（成都泰盟軟件有限公司）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司，Centrifuge5417R）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MD 公司）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf）；艾科浦超純水系統(tǒng)（中國(guó)重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司，AD3L）；電子天平（上海菁海儀器有限公司，F(xiàn)A2004N）；BHWY-100BC 恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州杰博森儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃精水提液的制備

根據(jù)《中國(guó)藥典》（2020年版）黃精臨床指導(dǎo)用藥用量9 ～15 g[26]，參考陳奇主編的《中藥藥理研究方法學(xué)》，查表可得人和大鼠間體表面積的折算系數(shù)為6.3[27]。按臨床指導(dǎo)每年平均用藥量9 g、12 g、15 g 換算成大鼠的用藥量，即大鼠用藥低、中、高劑量分別為0.945、1.26、1.575 g·kg-1。取適量黃精，加入10 倍總生藥量的水，加熱提取兩次，每次2 h，合并濃縮水提物至0.945、1.26、1.575 g·kg-1，滅菌備用。

2.2 模型復(fù)制

實(shí)驗(yàn)采用雌激素與縮宮素聯(lián)合使用的方法制備大鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型，除了正常組以外，其余各組的每只大鼠均每日1 次灌胃給予戊酸雌二醇片，使各組大鼠子宮處于共情期，提高大鼠子宮的敏感程度。給藥周期為10 d，其中第1日和第10日每只大鼠給藥0.2 mg，第2日至第9日每只大鼠給藥0.1 mg，末次給藥1 h 后，各組大鼠腹腔注射縮宮素2 U/只[21]，觀察30 min 內(nèi)大鼠的疼痛反應(yīng)。將扭體反應(yīng)作為子宮強(qiáng)烈收縮即痛經(jīng)的指標(biāo)，同時(shí)扭體反應(yīng)也可以直觀地反映原發(fā)性痛經(jīng)模型建立成功。

2.3 分組與給藥

采用體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組的方法將大鼠分為正常組，陽(yáng)性對(duì)照組（婦科千金片），模型組，黃精水提物低、中、高劑量組，每組10 只。從給予戊酸雌二醇片第5日開(kāi)始，按照各組給藥劑量灌胃給藥，其中陽(yáng)性對(duì)照組給藥劑量為0.08 g·kg-1，黃精水提物低、中、高劑量組分別給予0.945、1.26、1.575 g·kg-1黃精水提物，正常組和模型組均灌胃給予等量大豆油，連續(xù)7 d。

2.4 行為學(xué)測(cè)試

扭體表現(xiàn)為大鼠腹部向內(nèi)凹陷、軀干和后肢伸展、臀部和一側(cè)的肢體內(nèi)旋[21-23]，有時(shí)還有抱頭舔腹的行為。最后一次灌胃給予戊酸雌二醇片1 h 后，觀察注射完縮宮素后10 ～30 min 內(nèi)大鼠的扭體反應(yīng)情況，記錄扭體潛伏時(shí)間和扭體次數(shù)。結(jié)果與正常組相比，模型組大鼠扭體潛伏時(shí)間顯著縮短（P＜0.05），扭體次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，黃精低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組均可延長(zhǎng)扭體潛伏時(shí)間，降低扭體次數(shù)（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。

圖1 黃精對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠扭體反應(yīng)的影響Fig 1 Effect of Polygonatum on writhing responses in rats with primary dysmenorrhe

2.5 大鼠血清中6-keto-PGF1α 和β-EP 含量以及大鼠子宮組織中PGF2α 和PGE2 含量的測(cè)定

末次給藥后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL·kg-1）麻醉，將大鼠仰臥置于解剖臺(tái)上，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，全血室溫靜置10 ～20 min 至血液凝固后離心，3000 r·min-1離心15 min 后留取血清。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP的含量。

取大鼠子宮組織，按1∶9 比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS），勻漿后離心，取上清液，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定大鼠子宮組織中PGF2α和 PGE2的含量。

與正常組相比，模型組大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，黃精高劑量組、中劑量組、低劑量組均可顯著提升大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP 的含量（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2A、2B。

與正常組相比，模型組大鼠子宮組織中PGF2α水平顯著升高（P＜0.05），PGE2含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，黃精中劑量組可降低大鼠子宮組織中PGF2α的含量，提升PGE2的含量（P＜0.001），從而使PGF2α/PGE2的比值降低，緩解痛經(jīng)。結(jié)果見(jiàn)圖2C、2D。

圖2 黃精對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠生化指標(biāo)的影響Fig 2 Effect of Polygonatum on biochemical indexes in rats with primary dysmenorrhea

2.6 組織病理學(xué)檢測(cè)

分離子宮組織，浸泡于4%多聚甲醛緩沖液中，固定。石蠟包埋后，進(jìn)行常規(guī)的HE 染色，觀察子宮病理變化情況。

由圖3可見(jiàn)，正常組大鼠子宮組織形態(tài)正常，組織平滑形態(tài)清晰，而模型組大鼠子宮組織內(nèi)膜變薄，上皮細(xì)胞空泡樣變，子宮肌層有充血現(xiàn)象。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞少量空泡樣病變。黃精高劑量組大鼠子宮上皮細(xì)胞空泡病變基本消失，充血現(xiàn)象明顯改善。黃精中劑量組大鼠子宮內(nèi)膜相對(duì)平整，空泡樣病變基本消失。黃精低劑量組大鼠子宮上皮細(xì)胞空泡變化有所改善。

圖3 黃精對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠子宮組織病理變化的影響（HE，×200）Fig 3 Effect of Polygonatum on histopathological changes of uterus of rats with primary dysmenorrhea（HE，×200）

2.7 縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮程度的測(cè)定

將大鼠麻醉后解剖，完全暴露子宮，快速剪取一側(cè)子宮，立即放置在盛有樂(lè)氏液的玻璃平皿中充分清洗干凈，仔細(xì)清除子宮上殘留的結(jié)締組織和脂肪，用樂(lè)氏液沖洗子宮，將子宮內(nèi)容物充分洗凈，在整個(gè)過(guò)程中注意不要過(guò)分拉伸子宮。然后剪取中間段子宮平滑肌約2 cm，注意必須現(xiàn)取現(xiàn)用，避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)子宮平滑肌失去活性。平滑肌兩端分別系上縫合線，將HW200S 恒溫平滑肌實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的溫度調(diào)整至37℃，管內(nèi)加入足量樂(lè)氏液，將系上縫合線的子宮平滑肌置于該系統(tǒng)內(nèi)，使陰道端固定于小鉤上并固定在管內(nèi)，另一端連接在張力傳感器上。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)向樂(lè)氏液內(nèi)通入氧氣，速度為每1 ～2 s 一個(gè)氣泡，使子宮平滑肌正常自主收縮。通過(guò)BL-420N 信號(hào)采集與分析系統(tǒng)記錄大鼠離體子宮平滑肌的收縮曲線，先穩(wěn)定半小時(shí)至子宮收縮穩(wěn)定后，先記錄一段子宮正常收縮曲線6 min，然后向管內(nèi)加入縮宮素50 μL，記錄曲線1 min，隨后依次向管中加入各種藥液，分別記錄曲線6 min。最后對(duì)曲線進(jìn)行分析，得出張力值和頻率，并計(jì)算活動(dòng)度（活動(dòng)度＝平均張力值×頻率）。

與模型組大鼠相比，黃精組與陽(yáng)性對(duì)照組的子宮組織張力，收縮頻率及活動(dòng)度均有明顯變化；黃精高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的子宮組織平滑肌平均張力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。黃精高劑量組、黃精中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的子宮組織收縮頻率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。黃精中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的子宮組織平滑肌活動(dòng)度也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。其中黃精高劑量組較黃精組其他兩組效果較優(yōu)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃精對(duì)縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響(n ＝6，x±s)Tab 1 Effect of Polygonatum on oxytocin induced contraction of isolated rat uterine smooth muscles (n ＝6，x±s)

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所有檢查結(jié)果經(jīng)SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD 分析，方差不齊時(shí)用Dunnett’s方法分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

痛經(jīng)是婦科臨床的常見(jiàn)病，癥狀嚴(yán)重的患者甚至?xí)柝?，給廣大女性帶來(lái)諸多困擾。研究原發(fā)性痛經(jīng)，需要選擇合適的動(dòng)物模型，目前公認(rèn)的關(guān)于原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型是用雌激素與縮宮素聯(lián)合使用建立[14]。因此，本研究采取這種方法復(fù)制原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型，研究黃精對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的藥效作用。

原發(fā)性痛經(jīng)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，然而大多數(shù)研究者認(rèn)為原發(fā)性痛經(jīng)的產(chǎn)生與前列腺素、縮宮素、前列環(huán)素及其他一些因素有關(guān)。其中PGE2和PGF2α發(fā)揮主要作用。研究表明痛經(jīng)患者的子宮內(nèi)膜和經(jīng)血中PGF2α濃度會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常女性，痛經(jīng)越嚴(yán)重，患者體內(nèi)的PGF2α/PGE2的比值越高[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃精能夠降低原發(fā)性痛經(jīng)大鼠子宮組織中PGF2α的含量，提升PGE2的含量，降低PGF2α/PGE2的比值，抑制子宮收縮。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)子宮中β-內(nèi)啡肽含量上升時(shí)，其內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用會(huì)使子宮疼痛減輕，子宮慢慢恢復(fù)正常，而當(dāng)子宮中β-內(nèi)啡肽含量過(guò)低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致子宮收縮異常，進(jìn)而導(dǎo)致痛經(jīng)的產(chǎn)生[24]。除此之外，PGI2 含量降低則會(huì)造成子宮收縮異常、肌張力增高、收縮頻率增加，從而導(dǎo)致子宮血流量降低，子宮缺血，痙攣等從而引發(fā)痛經(jīng)。6-keto-PGF1α是PGI2 的代謝產(chǎn)物，其性質(zhì)穩(wěn)定，所以可以測(cè)量其代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α的含量，以此間接反應(yīng)PGI2 的水平[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃精可顯著提升大鼠血清中β-EP 和6-keto-PGF1α的含量。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，痛經(jīng)大鼠子宮過(guò)度收縮，造成子宮組織損傷，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。黃精組大鼠子宮內(nèi)壁空泡變化有所改善、充血現(xiàn)象明顯改善、子宮內(nèi)膜相對(duì)光滑平整。同時(shí)，黃精組能顯著降低痛經(jīng)大鼠子宮收縮頻率和收縮張力，達(dá)到緩解痛經(jīng)的效果。

綜上，本實(shí)驗(yàn)首次在黃精原有的藥理作用上，以黃精的抗炎、鎮(zhèn)痛、補(bǔ)陰益腎作用為基礎(chǔ)，進(jìn)而探究黃精對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型的藥效作用。本研究結(jié)果提示黃精可能對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)具有藥效作用，為黃精的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。