靜息態(tài)功能MRI觀察血管性癡呆大鼠模型全腦局部一致性

賀 歡，丁文才

(1.十堰市人民醫(yī)院放射影像中心，湖北 十堰 442000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150000)

血管性癡呆(vascular dementia， VD)主要指與腦血管病相關(guān)的認(rèn)知、記憶功能損傷及精神行為異常[1]，臨床表現(xiàn)與阿爾茲海默病較為相似，鑒別診斷困難；隨著MRI技術(shù)的發(fā)展，靜息態(tài)功能MRI(resting-state functional MRI， rs-fMRI)及相關(guān)分析技術(shù)用于缺血性腦小血管病[2]，可觀察能夠間接反映神經(jīng)元活動的接近生理狀態(tài)下腦內(nèi)血氧水平依賴(blood oxygenation level dependent， BOLD)信號自發(fā)活動。已有研究以fMRI所示局部一致性(regional homogeneity， ReHo)[3]及功能連接[4]評價VD患者，發(fā)現(xiàn)額葉-皮質(zhì)下環(huán)路受損可能與認(rèn)知功能損害有關(guān)，但部分腦區(qū)ReHo結(jié)果存在一定矛盾，可能與MR設(shè)備的分辨力、個體差異及患者配合度等因素相關(guān)。本研究采用rs-fMRI評價VD大鼠全腦ReHo變化，并觀察其行為學(xué)改變。

1 材料與方法

1.1 建立實驗動物模型 50只Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(黑)2013-002號，分別納入VD組(n=35)和對照組(n=15)，常規(guī)飼養(yǎng)，溫度(21.0±1.0)℃，濕度50%，明暗交替，自由采食與飲水，3日后停飼12 h造模。

經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg體質(zhì)量)麻醉大鼠后保定于小動物手術(shù)臺，對頸部區(qū)域進(jìn)行常規(guī)備皮、消毒及鋪巾。沿大鼠頸部正中做切口，暴露雙側(cè)頸總動脈，分離迷走神經(jīng)后，對VD組以細(xì)線結(jié)扎大鼠一側(cè)頸總動脈兩端并將其剪斷，待大鼠生命體征平穩(wěn)后分離另側(cè)頸總動脈，以動脈夾夾閉15 min后通血10 min，反復(fù)3次后予以永久性結(jié)扎；對照組僅行假手術(shù)，分離大鼠雙側(cè)頸總動脈而不予結(jié)扎。手術(shù)期間注意保暖，觀察大鼠生命體征變化；術(shù)后逐層縫合皮膚并消毒，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)4周。

1.2 Morris水迷宮實驗 以4個象限中的任意一點作為大鼠入水點，將其面向池壁放入水中，記錄其游泳路線及爬上平臺的時間(逃避潛伏期)。若大鼠于90 s內(nèi)爬上平臺即結(jié)束實驗，超期則將其引導(dǎo)至平臺上并停留10 s后結(jié)束實驗。每只大鼠每日學(xué)習(xí)2次，持續(xù)5日[5-6]。

1.3 圖像采集 采用Bruker 9.4T MR儀，大鼠腦表面線圈。予大鼠吸入5%異氟烷進(jìn)行麻醉，掃描期間持續(xù)吸入1%～2%異氟烷以維持麻醉，并以小型氣動枕頭傳感器(美國SA儀器有限公司)連續(xù)監(jiān)測其呼吸狀態(tài)。采集大鼠顱腦軸位、冠狀位及矢狀位MRI，參數(shù)：T2WI，TR 3 000 ms，TE 33 ms，F(xiàn)OV 30 mm×30 mm，層數(shù)30，層厚1.0 mm，矩陣256×256，回波鏈長8；行T2液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)(fluid attenuated inversion recovery， FLAIR)序列掃描，TR 3 500 ms，TE 15 ms，層數(shù)50，層厚0.5 mm，矩陣100×100，F(xiàn)OV 30 mm×30 mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用Matlab R2016b平臺中的統(tǒng)計參數(shù)映射(statistic parametric mapping， SPM)12軟件及rs-fMRI數(shù)據(jù)處理助手(data processing assistant for rs-fMRI， DPARSF)V4.3版對rs-fMRI數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。排除大鼠腦結(jié)構(gòu)異常及成像質(zhì)量不佳者。將DICOM數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換為NIFTI格式，剔除前10個時間點的圖像后，行去顱骨化處理、時間校正及頭動校正，剔除頭動>2 mm，旋轉(zhuǎn)>2°的圖像?；诿商乩麪柹窠?jīng)研究所(Montreal Neurological Institute， MNI)坐標(biāo)，利用空間歸一化將所獲數(shù)據(jù)配準(zhǔn)至同一標(biāo)準(zhǔn)空間。

計算目標(biāo)體素及其相鄰26個體素的肯德爾一致性系數(shù)(Kendall's consistency coefficient， KCC)，作為ReHo值，用于代表其在同一時間序列和空間位置上的活動一致性或相似度，以間接反映神經(jīng)元活動的同步性，取值范圍為0～1，即局部腦區(qū)ReHo值增加代表神經(jīng)元活動同步性增強、腦區(qū)活躍，ReHo值減低提示神經(jīng)元活動同步性降低。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件。以雙樣本t檢驗比較2組大鼠逃逸潛伏期的差異。采用雙樣本t檢驗比較2組大鼠ReHo值存在差異的腦區(qū)，以GFR法校正多重比較，以校正前單個體素P<0.01、團簇>49個體素和校正后P<0.05區(qū)域為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的腦區(qū)。

2 結(jié)果

造模后VD組12只大鼠死亡，3只于圖像分析過程中被排除，最終VD組共20只；對照組1只大鼠因麻醉死亡，4只圖像分析過程中被排除，最終對照組10只大鼠納入實驗。

2.1 VD大鼠行為學(xué)改變 Morris水迷宮實驗中，對照組大鼠可于短時間內(nèi)找到平臺，而VD組耗時較長；隨著學(xué)習(xí)次數(shù)增加，2組大鼠逃逸潛伏期均逐漸縮短，但各時間點VD組逃逸潛伏期仍長于對照組(P均<0.01)，見圖1、2。

2.2 VD大鼠ReHo值改變 VD組大鼠雙側(cè)紋狀體ReHo值低于對照組(P<0.05，GFR校正)，右側(cè)背外側(cè)內(nèi)嗅皮層、右側(cè)新腦皮層ReHo值高于對照組(P均<0.05，GFR校正)，見表1及圖3。

表1 VD組與對照組大鼠ReHo值存在差異的腦區(qū)

3 討論

目前用于制備VD動物模型的方法包括血管阻斷法、血管栓塞法、顱內(nèi)注射及轉(zhuǎn)基因法等[9]。血管阻斷法主要通過夾閉或結(jié)扎大鼠頸總動脈減少其腦部供血。直接阻斷大鼠雙側(cè)頸總動脈法重復(fù)性好、可致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損明顯，且無神經(jīng)功能缺損癥狀，但所致大鼠死亡率較高[10]，甚至達(dá)65%[11]。本研究采用兩步血管阻斷法，先結(jié)扎一側(cè)頸總動脈，之后對另側(cè)頸總動脈先間歇阻斷后再予結(jié)扎，操作簡便，常用于建立慢性低灌注及白質(zhì)損傷動物模型，可使動物出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)、記憶功能障礙，具有慢性、持續(xù)性等特點，且不引起明顯的感覺、運動功能損害。水迷宮實驗通過訓(xùn)練黑暗環(huán)境下大鼠辨別方向的能力，可測試其學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究各時間點VD組大鼠逃逸潛伏期均較對照組明顯延長，提示VD組大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能均已出現(xiàn)障礙。

紋狀體屬于基底神經(jīng)節(jié)，主要包括尾狀核與殼核，其功能為調(diào)節(jié)肌肉張力、協(xié)調(diào)精細(xì)復(fù)雜運動。近年來，越來越多的研究表明紋狀體在學(xué)習(xí)認(rèn)知方面也具有舉足輕重的作用，如LI等[12]發(fā)現(xiàn)紋狀體多巴胺能功能可隨語言功能下降而緩慢降低，尾狀核頭在此過程中起關(guān)鍵作用，而殼核則通過影響強化學(xué)習(xí)和內(nèi)隱學(xué)習(xí)參與學(xué)習(xí)、認(rèn)知過程。紋狀體由深穿支動脈供應(yīng)，為腦神經(jīng)回路的重要中轉(zhuǎn)站。結(jié)扎VD大鼠雙側(cè)頸總動脈可使其血腦屏障損傷、神經(jīng)元細(xì)胞損傷和腦灌注減少，導(dǎo)致紋狀體損傷；紋狀體損傷與海馬引起的認(rèn)知功能下降具有協(xié)同作用，可進(jìn)一步導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。本研究發(fā)現(xiàn)VD組大鼠紋狀體ReHo值較對照組減低，進(jìn)一步證實紋狀體功能降低可能與大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知下降相關(guān)；VD大鼠腦灌注降低致紋狀體區(qū)神經(jīng)元活動異常，使其神經(jīng)元同步性降低，而紋狀體ReHo減低則影響多巴胺信號的傳遞，進(jìn)而影響大鼠認(rèn)知功能，與THERMENOS等[13]的結(jié)論相似。

大鼠內(nèi)外側(cè)內(nèi)嗅皮層分工不同，內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層主要負(fù)責(zé)編碼空間信息，而外側(cè)內(nèi)嗅皮層主要編碼嗅覺及形狀等信息。LEE等[14]采用光遺傳學(xué)技術(shù)、單細(xì)胞電生理記錄和光纖記錄系統(tǒng)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)受多巴胺信號控制的小鼠外側(cè)內(nèi)嗅皮層扇形細(xì)胞在關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)過程中具有關(guān)鍵作用：大腦將任務(wù)相關(guān)信息發(fā)送至海馬前，外側(cè)內(nèi)嗅皮層接受來自嗅覺區(qū)域的氣味信息并進(jìn)行轉(zhuǎn)換，成為獎賞相關(guān)信息，提示外側(cè)內(nèi)嗅皮層直接編碼獎賞相關(guān)學(xué)習(xí)記憶[14]。新腦皮層為大鼠大腦中較晚出現(xiàn)的區(qū)域，但其體積逐漸增大，是大部分感覺的匯總區(qū)，也是許多高級認(rèn)知的關(guān)聯(lián)皮層。本研究發(fā)現(xiàn)VD組大鼠右側(cè)背外側(cè)內(nèi)嗅皮層及右側(cè)新腦皮層ReHo值較對照組明顯提高，提示水迷宮學(xué)習(xí)任務(wù)中，背外側(cè)內(nèi)嗅皮層處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)，ReHo值提高可能與VD組大鼠對位置信息的學(xué)習(xí)能力較差，須通過代償性提高外側(cè)內(nèi)嗅皮層功能以彌補編碼空間位置信息的能力缺失有關(guān)；新腦皮層ReHo值提高同樣可能為代償性反應(yīng)，但其具體機制尚不明確，有待進(jìn)一步觀察。

綜上，VD大鼠模型局部ReHo值與對照組存在差異，其雙側(cè)紋狀體、右側(cè)背外側(cè)內(nèi)嗅皮層及右側(cè)新腦皮層改變可能與認(rèn)知功能下降有關(guān)。但本研究樣本量小，未進(jìn)一步分組觀察，且未進(jìn)行相關(guān)血液因子檢測，有待后續(xù)加以完善。