一種新型無毒的氨氮含量檢測方法及其干擾因素探究

孔令明， 陳知雨， 徐瑜聰， 賈昌鋒

（山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東 威海 264209）

0 引 言

水體中的氨氮由非離子化的氨（NH3）和銨（NH4+）組成，這兩種存在形式處于與pH 和溫度相關(guān)的平衡狀態(tài)。當(dāng)水的pH 值低于8.75 時，NH4+是最主要的存在形式，NH4+相對無毒，而當(dāng)pH 值高于9.75時則NH3為主，NH3的毒性較高。NH3的比例隨著pH 值和溫度的升高而增加［1］。氨氮作為我國水污染的主要污染因子之一，是我國水體環(huán)境監(jiān)測的重要指標(biāo)，目前有4 種測定氨氮（ammonia nitrogen，NH3-N）的國家標(biāo)準(zhǔn)［2］。

本科生的教學(xué)和科研中，常要監(jiān)測養(yǎng)殖環(huán)境水體，發(fā)酵液中的氨氮含量。常用的測定方法包括納氏比色法、吲哚酚藍(lán)（IPB）比色法、水楊酸比色法和蒸餾-中和滴定法等［3-4］。納氏比色法所必需的納氏試劑是一種由碘化汞（HgI2）或者二氯化汞（HgCl2）和碘化鉀（KI）在強(qiáng)堿性溶液中組成的溶液，它與NH3反應(yīng)生成淡紅棕色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在420 nm 有吸收峰，吸光度在一定范圍內(nèi)與NH3的含量成正比［5］。IPB 比色法基于Bethelot 反應(yīng)，其中NH3在堿性條件下與苯酚和次氯酸反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再與另一分子苯酚反應(yīng)生成與樣品中NH3濃度成正比的藍(lán)色吲哚酚［6］。水楊酸鹽法實(shí)際上是IPB法的改進(jìn)，其中水楊酸鈉代替苯酚。這種改進(jìn)消除了有毒且易揮發(fā)的鄰氯苯酚的產(chǎn)生。在水楊酸法中，NH3與次氯酸反應(yīng)生成的一氯胺，再與水楊酸反應(yīng)生成藍(lán)綠色的5-氨基水楊酸鹽［7］。以上方法雖然得到了廣泛應(yīng)用，但缺點(diǎn)也顯而易見，那就是所用試劑往往含有危險物質(zhì)，容易造成人員傷害和環(huán)境污染。其中，納氏分光光度法需使用HgI2或HgCl2等劇毒物質(zhì)，并且試劑的壽命相對較短，反應(yīng)易受pH值和時間的影響；IPB法用到的苯酚有毒、且具腐蝕性氣味；水楊酸分光光度法需使用濃硫酸，且使用前需對有次氯酸鈉溶液的有效氯濃度和游離堿濃度進(jìn)行標(biāo)定，流程繁瑣［8］。蒸餾-中和滴定法同樣需使用濃硫酸試劑，且實(shí)驗(yàn)為滴定實(shí)驗(yàn)，操作復(fù)雜、人為誤差較大。在高校本科實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)安全是最重要的也是最受人們關(guān)注的問題［9-10］，而這些實(shí)驗(yàn)方法均會對實(shí)驗(yàn)室安全及實(shí)驗(yàn)人員的安全造成潛在威脅。

Ma等［11］在傳統(tǒng)IPB 的基礎(chǔ)上，做了幾個方面的優(yōu)化，如用鄰苯基苯酚（OPP）代替有毒和有氣味的苯酚。OPP是一種無毒、無腐蝕性且穩(wěn)定存在的片狀晶體；用二氯異氰尿酸鈉替換了不穩(wěn)定的次氯酸鈉試劑。該研究還在不同的試劑濃度、溫度和鹽度下優(yōu)化了OPP反應(yīng)的動力學(xué)。該系統(tǒng)具有反應(yīng)相對快，毒性低和試劑制備方便的優(yōu)點(diǎn)。本研究選擇了不同年級的大學(xué)生評估了該方法的可重復(fù)性，并探索了該方法的干擾因素，為該方法的進(jìn)一步應(yīng)用提供改進(jìn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與耗材

試劑：檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7，CAS 號：68-04-2）；鄰苯基苯酚（OPP，CAS 號：90-43-7）；二氯異氰尿酸鈉（NaDTT，CAS 號：2893-78-9）；硝普鈉（NP，CAS號：13755-38-9）；氯化銨（NH4Cl，CAS 號：12125-02-9）；氫氧化鈉（NaOH，CAS 號：1310-73-2）；三氯化鐵（FeCl3，CAS號：7705-08-0）；超純水（18.2 MΩ·cm）。

耗材：50 mL 離心管；0.45 μm 過濾器；100 mL 容量瓶、100 mL 量筒。本方法所使用到的器皿，均應(yīng)經(jīng)堿性水（超純水用NaOH調(diào)到pH 9.5）清洗，以去除殘余的氨氮。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，DGG-9140B型）；紫外可見分光光度計（上海美析儀器有限公司，UV-1800）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，JY92-IIN）；恒溫培養(yǎng)搖床（哈東聯(lián)，HZQ-F160）；10 mm石英比色皿。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制

（1）飽和檸檬酸三鈉溶液。將42.5 g 檸檬酸三鈉溶解在100 mL水中，加熱溶解，制得飽和檸檬酸三鈉溶液（4 ℃保存可穩(wěn)定數(shù)月）。

（2）20 g/L 堿性O(shè)PP 溶液。將2 g OPP 和1 g NaOH溶解在水中，定容至100 mL，制得20 g/L 堿性O(shè)PP溶液（4 ℃保存可穩(wěn)定至少10 天）。

（3）10 g/L堿性NaDTT溶液。將1 g NaDTT和1 gNaOH溶解在水中，定容至100 mL，制得10 g/L堿性NaDTT溶液（4 ℃保存可穩(wěn)定至少10 天）。

（4）5 g/L 堿性NP 溶液。將0.5 g NP 和6 g NaOH溶解在水中，定容至100 mL，制得5 g/L 堿性NP溶液（4 ℃保存可穩(wěn)定至少10 天）。（5）NH4Cl溶液的制備。制備前需用烘箱105 ℃干燥2 h。將干燥的NH4Cl 溶于超純水制備20 mg/L的NH4Cl溶液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)原理

在堿性環(huán)境下，NH3與次氯酸鹽在NaDTT催化下反應(yīng)生成一氯胺；一氯胺與OPP反應(yīng)生成2-苯代對本醌氯亞胺；2-苯代對本醌氯亞胺再與OPP 反應(yīng)形成靛藍(lán)的吲哚酚（IPB），顏色的深淺與NH3的濃度具有顯著的相關(guān)性，并在700 nm處有最高吸收峰。反應(yīng)式及化學(xué)符號如下［11］：

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

選擇大學(xué)二年級、三年級、四年級本科生各10 名，分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

（1）實(shí)驗(yàn)開始前需用少量堿性水（pH 9.5）潤洗所有實(shí)驗(yàn)儀器，除去殘余的氨氮的干擾，并用超純水洗凈晾干，用于試劑制備（除定容外，其他操作均在聚丙烯管中進(jìn)行）。

（2）分別取20 mg/L的NH4Cl溶液按表1 所示要求進(jìn)行稀釋操作，制備標(biāo)準(zhǔn)液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。

（3）取25 mL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品于50 mL 離心管，加入4 mL飽和檸檬酸三鈉溶液，充分混勻。

（4）加入1 mL OPP溶液，充分混勻。

（5）加入1 mL NaDTT溶液，充分混勻。

（6）加入1 mL NP 溶液，充分混勻，靜置20 min（形成的IPB最長能穩(wěn)定24 h），使用10 mm石英比色皿，檢測其在700 nm處吸光度。

表1 用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度梯度

1.3 準(zhǔn)確度與精密度

1.3.1 準(zhǔn)確度

檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度可采用加標(biāo)回收評估法。國標(biāo)中對加標(biāo)回收率的定義為：儀器通過分別測定加入標(biāo)準(zhǔn)溶液前后的實(shí)際水樣得到的增量相對于加入已知量的百分率。分別吸取試劑1、4、7、8 號標(biāo)準(zhǔn)液，測定其顯色后的吸光度，并根據(jù)結(jié)果選擇相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出添加量，計算加標(biāo)回收率。

1.3.2 精密度

精密度采用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，relative standard deviation）進(jìn)行評價。按照《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ168—2020）的要求計算RSD［12］。

1.4 影響因素探究

1.4.1 氨基酸的影響

分別取0.1 g脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、丙氨酸，配置成1 g/L 的母液100 mL。分別稀釋成為50、100、200、400 mg/L，用NH4Cl 標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)整各梯度組中NH3-N 的含量為0.64 mg/L，然后依次加入檸檬酸三鈉飽和溶液、OPP、NaDTT、NP 混勻配置成待檢測液，靜置后測定其在700 nm處吸光值。

1.4.2 三價鐵離子的影響

配制200 mg/L 的FeCl3溶液與200 mg/L 的NH4Cl溶液，然后配制成含50、100 mg/L FeCl3的0.64 mg/L NH4Cl的工作液，后依次加入檸檬酸三鈉飽和溶液、OPP、NaDTT、NP 混勻配置成待檢測液，靜置后測定其在700 nm處吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

2.1.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過30 次不同年級操作人員的重復(fù)測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值均在0.99 以上（見圖2），表明該實(shí)驗(yàn)方法操作簡便，可重復(fù)性較高。

2.1.2 精密度與準(zhǔn)確度

根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 1.119 8x+ 0.053（R2= 0.999 8）（后續(xù)氨氮計算均使用此方程）與測定吸光度計算所測標(biāo)準(zhǔn)液濃度，分別計算RSD值與加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2、3。

圖2 氨氮測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 RSD值計算

表3 加標(biāo)回收率計算

研究結(jié)果顯示，不同濃度下RSD 勻小于3%，加標(biāo)回收率為100.9% ～109.5%，因此該方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足水樣中NH3-N的分析測定要求。

2.2 氨氮測定影響因素探究

2.2.1 氨基酸對氨氮測定的影響

本研究分別選取了甲硫氨酸、丙氨酸、色氨酸、甘氨酸4 種一級氨基酸，以及脯氨酸這種二級氨基酸來探究其在不同濃度下對氨氮測定的影響（見表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸對氨氮測定產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，并且在同樣質(zhì)量體積下小分子的丙氨酸和甘氨酸影響最大。因此在測定氨基酸含量高的廢水、發(fā)酵液時要予以特別注意。

表4 不同濃度氨基酸對氨氮測定的影響 mg/L

2.2.2 Fe3+對氨氮測定的影響

檸檬酸三鈉能有效地螯合二價金屬離子如鈣離子、鎂離子等，以消除這些離子對結(jié)果的影響，但在堿性條件下其螯合三價鐵離子的能力較差［13］。Fe3+在小于8.631 mg/L 時基本不會影響氨氮的測定，但當(dāng)Fe3+濃度達(dá)到17.262 mg/L 時，對測定結(jié)果產(chǎn)生較大影響，使測定值達(dá)到實(shí)際值的2 倍（見表5）?，F(xiàn)有方法對樣品的前處理多從去除鈣、鎂離子出發(fā)［14］，而并未有效除去三價金屬離子，如Fe3+，從而可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。

表5 不同濃度Fe3+對氨氮測定的影響

3 結(jié) 論

氨氮的測定在水產(chǎn)養(yǎng)殖、環(huán)境監(jiān)測、發(fā)酵液水質(zhì)監(jiān)測中具有至關(guān)重要的作用［15］。新型無毒的氨氮含量檢測方法具有以下幾個方面的優(yōu)點(diǎn)：①所用試劑相對穩(wěn)定，不受鹽度干擾；②與國標(biāo)法中需要的HgCl2、HgI2和濃H2SO4等劇毒、強(qiáng)腐蝕性試劑相比，該方法所用試劑安全無毒，實(shí)驗(yàn)操作更加簡便，且試劑與顯色產(chǎn)物更加穩(wěn)定，利于長時間保存，降低了實(shí)驗(yàn)操作帶來的誤差；③經(jīng)多位同學(xué)試驗(yàn)，均成功做出R2大于0.99的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且各組數(shù)據(jù)RSD值均小于3%，加標(biāo)回收率在100.9% ～109.5%之間，具有較高的準(zhǔn)確度、精密度和可重復(fù)性；④測定波長為700 nm，所用儀器簡單。因此，該法非常適用于本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)中水體氨氮濃度的測定。