桑葉水提物改善腸肌運動及緩解便秘的作用

段曉峰，王亞文，耿旭芳，趙 甜，李 麗，賈東升，趙 丁,

（1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050017；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，河北石家莊 050051）

便秘是臨床常見的消化道疾病，以排便困難、排便量少、糞便干結(jié)為主要表現(xiàn)，影響了全世界約20%的人口[1]，其中婦女和老年人患病率更高。輕型便秘影響生活質(zhì)量[2]，重型則會誘發(fā)癌癥[3]。便秘患者常常伴隨腸道組織形態(tài)、神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)遞質(zhì)和平滑肌功能的病變[4]。水通道蛋白（AQPs）是具有高度選擇性的水通道蛋白家族，腸道內(nèi)存在其多種亞型，如水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3），可以調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細胞對水的吸收程度[5]，在便秘腹瀉等胃腸道疾病中有重要地位。目前對于便秘的治療方法主要為瀉藥，如大黃[6?7]、番瀉葉[8?9]等，但其效果因人而異，可能伴有腹瀉等副作用。從大健康角度出發(fā)，尋求安全有效的改善便秘的方法，開發(fā)藥食同源產(chǎn)品不失為重要策略之一。

桑葉是?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥葉，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。桑葉改善腸道的作用較早見于《唐本草》，曰“煎汁服，止霍亂腹痛吐下，利大小腸”。桑樹在中國南北均有較大的種植面積，河北省也有豐富的桑葉資源。作為衛(wèi)生部公布的藥食兩用植物之一[10]，桑葉主要含有黃酮及黃酮苷類[11]、多酚、生物堿類（主要為1-脫氧野尻霉素（DNJ））[12]、多糖類、蛋白質(zhì)及常量元素[13]等成分[14]，具有降糖[15?16]、抗衰老[17]、軟便[18]及減肥[19]等功效。桑葉提取物對腸道功能的研究目前仍較少，袁淑青[20]用小鼠腸蠕動抑制模型研究發(fā)現(xiàn)，桑葉水提物具有改善小腸推進功能的作用。本團隊前期曾綜述了桑葉調(diào)節(jié)腸道功能[21]的作用，發(fā)現(xiàn)桑葉改善便秘的系統(tǒng)研究少，資源開發(fā)利用更顯不足。桑葉目前除霜桑葉入藥外，主要用于動物飼料[22?23]、制作桑葉茶、桑葉掛面等食品。

本研究運用離體腸肌功能實驗及便秘模型的構(gòu)建，觀察桑葉水提物對健康豚鼠離體回腸張力及便秘大鼠腸肌運動的影響，并通過結(jié)腸組織形態(tài)及免疫組化等方法探究桑葉水提物改善便秘的作用及相關(guān)機制，以期為桑葉資源的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 采自滄州市中捷農(nóng)場，桑葉水提物由河北醫(yī)科大學(xué)生藥教研室提供；SPF 級健康豚鼠8 只，雌雄兼?zhèn)?，體質(zhì)量300～450 g 由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2018-004；Wistar大鼠34 只，SPF 級，雌性，體質(zhì)量180～220 g 購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號：SCXK（魯）20190003。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±1） ℃，相對濕度45%～65%，12 h/12 h 明暗交替。所有動物實驗均遵循3R 原則。氯化卡巴膽堿（CCh） Sigma公司，批號BCBK0156V；Aquaporin 3（AQP3）抗體Arigo 公司，批號70710；兔SP 試劑盒（SP-9001），批號2005E1124、DAB 顯色試劑盒，批號212300203北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鹽酸洛哌丁胺東京化成工業(yè)株式會社，批號4DIIB-GA；硫酸鋇Macklin 公司，批號C11467428。

MedLab-U/4C501H 型生物信號采集處理系統(tǒng)南京美易科技有限公司；XH200 型等長收縮換能器（10 g） 北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司；SC-15 數(shù)控超級恒溫槽 寧波市海曙天恒儀器廠；RM2135 型切片機 德國LEICA 公司；CX31 型顯微鏡 Olympus公司；Image-Pro Plus 圖像分析軟件 Media Cybernetics 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉水提物制備 稱取干桑葉適量，置于60 ℃烘箱烘干1 h，根據(jù)預(yù)實驗經(jīng)驗，取桑葉體積10～12 倍的蒸餾水，浸泡后，煎煮至沸騰，繼續(xù)小火煎煮60 min，加水二次煎煮，合并兩次濾液，小火濃縮，制得生藥濃度為1 g/mL 的桑葉水提物（成分含量：總黃酮14.6 mg/g，多糖17.8 mg/g）。

1.2.2 豚鼠離體腸肌張力的測定

1.2.2.1 離體回腸標本的制備 參考方法[24?26]，制備離體回腸標本。豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，禁食不禁水16 h，脫頸處死后，迅速剖開腹腔，取距離回盲部8～10 cm 處的一段回腸，用Krebs 液[24,27]（全部成分（mmol/L）：NaCl 133.13、KCl 4.69、NaH2PO4·2H2O 1.35、MgSO4·7H2O 0.61、無水CaCl22.52、NaHCO316.66、葡萄糖（C6H12O6·H2O）7.57）將腸管沖洗干凈，迅速放入盛有冷Krebs 液并通氧的培養(yǎng)皿中，剝離腸系膜及周圍脂肪，將腸管剪成約1 cm 長的腸段備用。用棉線將腸管兩端對角線結(jié)扎，一端固定于L 型鉤上，另一端與張力換能器相連，置于盛有10 mL的Krebs 液的浴槽內(nèi)，浴槽保持恒溫（37±0.5 ℃），持續(xù)通入95% O2+5% CO2的混合氣體（1～2 個氣泡/s），施加1 g 前負荷，每隔15 min 換液一次，待腸管穩(wěn)定后（約60 min）進行實驗。

1.2.2.2 桑葉水提物對豚鼠離體回腸收縮活動的影響 按照上述方法制備豚鼠回腸標本，待回腸收縮穩(wěn)定后，描記一段正常曲線，加入CCh 使其終濃度為1×10?11mol/L，以檢驗?zāi)c段是否有活性，2 min 后沖洗2 次并換液，待曲線恢復(fù)到給藥前水平，描記一段正常曲線，加入1 g/mL 桑葉水提物100 μL（低劑量），并描記曲線，孵育5 min 后，再給予相同劑量的CCh，并描記曲線，3 min 后沖洗2 次并換液，穩(wěn)定至少40 min，待曲線恢復(fù)至用藥前水平（無法恢復(fù)及活性異常的腸段不納入統(tǒng)計），再加入1 g/mL 桑葉水提物300 μL（高劑量），重復(fù)操作；觀察給藥前后2 min 平均張力和收縮幅度的變化。

1.2.3 便秘大鼠模型的建立 Wistar 雌性大鼠34 只適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分為空白對照組（10 只，3 d 和7 d 時該組均同步取材）、3 d 模型組、3 d 桑葉水提物組、7 d 模型組和7 d 桑葉水提物組各6 只，第8 d 開始造模給藥，桑葉水提物組上午灌胃桑葉水提物（5 g/kg/d，參照配伍劑量[28]，臨床上桑葉常用劑量為3～60 g，按照動物與人的劑量換算[29]，桑葉最大生藥劑量為5.29 g/kg），下午灌胃洛哌丁胺（10 mg/kg/d，文獻中常用劑量為1.5～15 mg/kg，造模時間短，選用相對較大劑量）；模型組上午灌胃生理鹽水，下午灌胃洛哌丁胺；空白對照組上午、下午均灌胃生理鹽水。

1.2.4 排便實驗 于給藥第4 d 或第8 d 檢測第一白便[30]排出情況。動物灌胃80%硫酸鋇混懸液4 mL 后單籠飼養(yǎng)，記錄排出第一白便所用時間，以反映全胃腸道傳輸功能。在檢測第一白便的同時，觀察各組大鼠24 h 內(nèi)排便情況，收集并記錄。

1.2.5 小腸炭末推進實驗 造模給藥結(jié)束后的大鼠，禁食不禁水一夜，實驗時每只大鼠灌胃2 mL 炭末混懸液（每50 mL=5 g 炭末+0.5 g 羧甲基纖維素鈉+蒸餾水），30 min 后擊頭處死，剖腹，小心沿腸系膜剪開，擺成一條直線幽門到回盲部的距離記為小腸全長，幽門至炭末前沿的距離為炭末推進距離，計算小腸推進率[31?32]，小腸推進率（%）=炭末推進距離/小腸全長×100。

1.2.6 卡巴膽堿誘發(fā)離體回腸收縮平均張力的測定造模給藥結(jié)束后的大鼠，禁食不禁水16 h，按照1.2.2.1 所述方法制備回腸標本，待回腸收縮穩(wěn)定后，描記一段正常曲線，加入CCh[33?34]使其終濃度為5×10?12mol/L，并描記收縮曲線，作用明顯后，沖洗2 次并換液，待曲線恢復(fù)到給藥前水平，描記一段曲線；再給予相同劑量的CCh，具體操作同上，觀察記錄給藥前后2 min 平均張力的變化。

1.2.7 HE 染色 按照文獻[34]，進行HE 染色觀察結(jié)腸組織病理變化。給藥結(jié)束后，各組大鼠取結(jié)腸組織于包因氏固定液固定24 h 后制成蠟塊，石蠟切片厚度5 μm，60 ℃烘箱烤片2 h，脫蠟至水，蘇木精染10 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，伊紅染1 min，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片，晾干后顯微鏡下觀察。

1.2.8 免疫組化染色 按照文獻[35]方法進行免疫組化染色。切片厚度5 μm，60 ℃烤片40 min，石蠟切片脫蠟至水，pH6.0 的抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，冷卻3 min，加熱至沸騰，反復(fù)3 次，冷卻至室溫，PBS 洗5 min×3 次，按照SP 法試劑盒說明書進行操作，滴加3% H2O2，室溫孵育25 min，PBS 洗5 min×3 次，滴加山羊血清工作液封閉，37 ℃孵育40 min，滴加AQP3 一抗（1:200，PBS 代替一抗作陰性對照）置濕盒于4 ℃冰箱過夜，PBS 洗5 min×6 次，滴加生物素二抗工作液（二抗與一抗為同種屬），37 ℃孵育35 min，PBS 洗5 min×6 次，滴加HRP 標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育35 min，PBS 洗5 min×6 次，滴加DAB 顯色液，顯微鏡下觀察到組織出現(xiàn)較明顯的著色后終止顯色，蘇木精染5 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。

1.2.9 免疫組化染色統(tǒng)計方法 在顯微鏡下（40 倍×10 倍），每個組織拍攝8 個互不重疊的視野圖片，利用Image-Pro Plus 6.0 軟件測量免疫組化染色圖片的積分光密度（IOD）以及有效統(tǒng)計區(qū)域面積（Area），計算單位面積的陽性表達即為平均光密度（MOD）[36]，最后計算每只大鼠8 張圖片的均值為該大鼠該種蛋白的表達結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤（mean±SE）表示，以SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計，給藥前后比較采用配對t檢驗，P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)差異；多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 時進一步運用LSD 進行兩兩比較；不符合正態(tài)性或方差齊性檢驗的數(shù)據(jù)采用KW H秩和檢驗，P<0.05 時進一步兩兩比較，圖表的處理采用GraphPad Prism 8.0 軟件完成。組織學(xué)圖片用長基醫(yī)療數(shù)碼成像軟件統(tǒng)一條件拍攝，Image-Pro Plus 6.0 進行圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉水提物對健康豚鼠離體回腸張力的影響

2.1.1 對豚鼠離體回腸自主運動的影響 桑葉水提物對豚鼠離體回腸張力的影響如圖1 所示。桑葉水提物的低劑量和高劑量均可促進豚鼠離體回腸的自主運動，低劑量桑葉水提物預(yù)處理后促進了CCh 誘導(dǎo)的離體回腸平均張力，而高劑量卻有一定抑制作用。

圖1 桑葉水提物對豚鼠離體回腸收縮張力的影響Fig.1 Effects of water extract of mulberry leaves on contractile tension of isolated ileum of guinea pigs

觀察桑葉水提物在37±0.5 ℃的Krebs 孵育液中對豚鼠離體回腸自主運動的影響，圖2 結(jié)果顯示，與給藥前相比，桑葉水提物的低劑量和高劑量均可明顯地刺激豚鼠離體回腸的自主運動，表現(xiàn)為平均張力升高，收縮幅度增強，說明桑葉水提物對離體回腸蠕動有明顯刺激作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），且有劑量依賴性。

圖2 桑葉水提物對豚鼠離體回腸自主運動的影響Fig.2 Effects of water extract of mulberry leaves on autonomous movement of isolated ileum of guinea pigs

2.1.2 桑葉水提物預(yù)處理后對卡巴膽堿誘發(fā)豚鼠離體回腸收縮平均張力的影響 觀察桑葉水提物預(yù)處理對CCh 誘發(fā)收縮平均張力的影響，圖3 結(jié)果表現(xiàn)為低劑量桑葉水提物預(yù)處理可促進CCh 誘導(dǎo)的離體回腸收縮平均張力，高劑量桑葉水提物則表現(xiàn)為抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。推測桑葉水提物中可能存在作用相反的成分，發(fā)揮整腸作用。梁萬年等[37]發(fā)現(xiàn)，高良姜總黃酮能有效抑制正常大鼠的腸運動及新斯的明所致的小腸推進亢進。前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，含黃酮成分較高的市售桑葉醇提物可抑制豚鼠的腸肌運動，故推測高劑量的桑葉水提物可能由于黃酮類成分含量較高而表現(xiàn)為抑制作用。為了進一步驗證桑葉水提物對便秘動物的調(diào)節(jié)作用，本團隊建立了便秘大鼠模型，并利用離體腸肌實驗反映便秘大鼠的腸運動情況，以探究桑葉水提物的作用。

圖3 桑葉水提物對卡巴膽堿誘發(fā)豚鼠離體回腸平均張力的影響Fig.3 Effects of water extract of mulberry leaves on carbaccholine-induced average tension of isolated ileum of guinea pigs

2.2 桑葉水提物對便秘大鼠常規(guī)觀測指標的影響

觀察各組大鼠第一白便時間及24 h 糞便粒數(shù)，結(jié)果顯示，與空白組相比，造模3 d 模型組第一白便時間顯著延長（P<0.05，圖4），與模型組相比，桑葉水提物組有所縮短；造模7 d 組作用不明顯，但變化趨勢相同。與空白組相比，造模3 d 模型組24 h 糞便粒數(shù)明顯減少（P<0.05，圖5），桑葉水提物組有一定回升；造模7 d 模型組24 h 糞便粒數(shù)有所減少，桑葉水提物組與模型組相比，明顯升高（P<0.05，圖5）。而且7 d 模型組第一白便時間較3 d 時有所縮短，推測可能由于隨著洛哌丁胺給藥時間的延長，對腸道抑制作用減弱，與文獻研究結(jié)果一致[38]。測定各組小腸推進率，結(jié)果顯示，與空白組相比，造模7 d 模型組的小腸推進率顯著降低（P<0.01，圖6），而桑葉水提物組則明顯高于模型組（P<0.05，圖6）。造模3 d 組作用不明顯，但也有相同趨勢。

圖4 各組大鼠第一白便時間Fig.4 The first defecation time of rats in each group

圖5 各組大鼠24 h 糞便粒數(shù)Fig.5 The fecal granules number of rats in each group at 24 h

圖6 各組大鼠小腸推進率Fig.6 Small intestine propulsion rate of rats in each group

2.3 桑葉水提物對卡巴膽堿誘發(fā)便秘大鼠離體回腸收縮平均張力的影響

桑葉水提物對卡巴膽堿誘發(fā)便秘大鼠離體回腸收縮張力的影響如圖7 所示。與空白組相比，3 d 和7 d 模型組的平均張力均顯著降低，且均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。與模型組相比，3 d 與7 d 桑葉水提物組的腸肌平均張力均明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05，P<0.01），說明便秘大鼠的腸蠕動減慢，可能與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)減少，平滑肌張力降低有關(guān)。這與文獻報道[1]便秘后興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平降低，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)升高是一致的。

圖7 桑葉水提物對便秘大鼠離體回腸平均張力的影響Fig.7 Effect of water extract of mulberry leaves on average tension of isolated ileum of constipation rats

2.4 桑葉水提物對便秘大鼠結(jié)腸組織形態(tài)及水通道蛋白表達的影響

HE 染色結(jié)果，造模3 d 和造模7 d，模型組肌層厚度輕度降低，桑葉水提物組肌層則有變厚的趨勢（圖8），與已報道結(jié)果一致[39]，說明便秘大鼠腸蠕動的減慢可能與腸肌變薄有關(guān)；AQP3 染色結(jié)果可知，造模3 d 時，模型組AQP3 有所降低，桑葉給藥后未見改善，可能是造模時間短，機體自身調(diào)節(jié)等因素引起的不穩(wěn)定；與空白組相比，造模7 d 模型組的AQP3表達水平有所升高，桑葉組顯著低于模型組，甚至低于空白組（P<0.05，P<0.05，圖9），說明洛哌丁胺給藥后可導(dǎo)致結(jié)腸對水分的過度吸收，降低結(jié)腸內(nèi)容物含水率，導(dǎo)致便秘，而桑葉水提物可通過降低AQP3 表達[5,40]，抑制水分過度吸收，緩解便秘。

圖8 各組大鼠結(jié)腸HE 染色（100×）Fig.8 Colon HE staining of rats in each group (100×)

圖9 各組大鼠結(jié)腸AQP3 免疫組化結(jié)果（400×）Fig.9 Immunohistochemical results of AQP3 in colon of rats in each group (400×)

3 討論與結(jié)論

便秘是以排便困難、排便次數(shù)減少、糞便干硬為主要表現(xiàn)的消化系統(tǒng)疾病[1,36,41]。有研究[31]總結(jié)了便秘相關(guān)的動物模型，復(fù)方地芬諾酯和洛哌丁胺灌胃法最常見，且造模時間多為7 d，本著將桑葉開發(fā)為功能食品或保健品預(yù)防便秘的原則，并探討不同給藥時間的效果，本研究通過洛哌丁胺灌胃給藥建立輕型便秘模型[42?43]，分別為造模3 d 和造模7 d，同時給桑葉水提物干預(yù)進行研究。結(jié)果表明，造模3 d 模型組第一白便時間與24 h 糞便粒數(shù)變化較為顯著，并且桑葉給藥后可降低便秘大鼠第一白便時間，增加排便量；造模7 d 模型組對應(yīng)指標變化較小，但桑葉水提物組均有一定改善；造模7 d 模型組小腸推進率較空白組顯著降低，桑葉水提物組較模型組顯著升高。離體腸肌運動反映了腸道動力功能，可作為評價便秘的良好指標[34]。本團隊對各組離體回腸給予相同劑量的卡巴膽堿，結(jié)果表明，便秘模型組的離體回腸平均張力明顯降低，而桑葉水提物給藥組與模型組相比有明顯改善，且造模7 d 模型組較造模3 d 模型組降低更為顯著。造模3 d 或造模7 d 模型組肌層厚度降低，而桑葉水提物組有所改善。結(jié)腸組織AQP3 免疫組化結(jié)果顯示，造模3 d時模型組有所降低，桑葉給藥后進一步降低；而造模7 d 時，模型組AQP3 升高，桑葉給藥后明顯降低。本實驗結(jié)果顯示，桑葉水提物對不同病程及給藥周期，均可通過增加排便，延長小腸推進，增厚腸道肌層，增強腸道收縮張力，降低AQP3，抑制結(jié)腸對水分的過度吸收等發(fā)揮緩解便秘、潤腸通便的作用。

桑葉作為藥食同源植物之一，在功能性食品開發(fā)領(lǐng)域有較大群眾基礎(chǔ)和產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢，但其主要的藥理作用和作用機制，尚未得到進一步的驗證，導(dǎo)致對桑葉的開發(fā)仍處于摸索狀態(tài)。本研究主要探索了桑葉水提物對便秘的影響，可知，便秘模型組排便減少，腸道蠕動減慢，結(jié)腸肌層變薄，AQP3 有一定增多；而桑葉水提物通過增加排便，促進腸道蠕動，使腸肌增厚，降低AQP3 表達水平，抑制結(jié)腸對水分的過度吸收等發(fā)揮潤腸通便的作用。為后續(xù)桑葉相關(guān)的功能性食品或保健品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。為了進一步探討桑葉改善便秘作用的主要化學(xué)成分，后期將研究桑葉不同提取部位對腸道的影響，包括桑葉總黃酮的澀腸作用等，并通過腸道菌群等研究進一步探討其改善便秘的作用機制。