牦牛膠原蛋白肽降血糖效果研究

李 金，黃 彪，劉惠考，陳 爍，雷紹南，容明強(qiáng)，謝華平,

（1.青海省德令哈市畜牧獸醫(yī)站，青海德令哈 817000；2.青海瑞肽生物科技有限公司，青海德令哈 817000；3.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)研究院，湖南長(zhǎng)沙 410006）

青海是全國(guó)最大的牦牛生產(chǎn)基地，牦?？倲?shù)占全國(guó)的三分之一以上，盛傳為“世界牦牛之都”[1]。獨(dú)有的高原環(huán)境、天然的放養(yǎng)方式，使牦牛擁有極強(qiáng)的免疫力、可靠的安全性和獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。其中，以牦牛皮為原料，通過(guò)酶解法制備具有抗高血壓、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等活性的膠原蛋白肽[3?5]，在食品、醫(yī)藥和美容行業(yè)均具有巨大的應(yīng)用前景。

食源性多肽作為天然降糖藥物已引起廣泛關(guān)注，像苦瓜肽、大豆肽和燕麥肽等植物源肽已被證明具有降血糖作用和高安全性特點(diǎn)[6?8]。近年來(lái)動(dòng)物源的膠原蛋白肽同樣被廣泛研究[9?11]，田許等[9]研究表明，以深海鮭魚(yú)的魚(yú)皮為原料提取的膠原蛋白肽可以改善高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，降低胰島細(xì)胞損傷，提高胰島素的生物學(xué)活性以改善糖代謝異常；王瑩等[10]研究表明，石斑魚(yú)膠原蛋白肽交叉苦瓜素可促進(jìn)糖尿病模型小鼠的臟器損傷修復(fù)，提高其自身免疫能力起到降血糖效果；王軍波等[11]研究表明，豬膠原蛋白多肽-鉻（Ⅲ）能活化免疫細(xì)胞[12]，提高小鼠機(jī)體的免疫力，一定程度地降低血糖。目前，牦牛皮膠原蛋白肽的降血糖功效還未見(jiàn)報(bào)道。

為了進(jìn)一步拓展牦牛皮膠原蛋白的功能多樣性，提高牦牛皮的附加值，促進(jìn)牦牛產(chǎn)業(yè)的開(kāi)發(fā)，本研究首次選用青海牦牛皮，通過(guò)酶切的方法提取低分子膠原蛋白肽，并檢測(cè)其對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型的降血糖作用和促進(jìn)高糖損傷INS-1 胰島細(xì)胞增殖作用，為研究牦牛膠原蛋白肽降低血糖的功效提供數(shù)據(jù)支持，為開(kāi)發(fā)輔助降血糖的功能性食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛皮 青海瑞肽生物科技有限公司；小鼠INS-1 胰島細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所；SPF 級(jí)昆明雄性小鼠（20±2）g，60 只，4 周齡，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（湘）2019-0004 長(zhǎng)沙史萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；胃蛋白酶（10 萬(wàn) U/g）、堿性蛋白酶（20 萬(wàn) U/g）生工生物有限公司；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸（451 Da）、桿菌肽（1422 Da）、抑肽酶（6511 Da）、細(xì)胞色素C（12327 Da）

上海源葉生物科技有限公司；四氧嘧啶 Solarbio公司；二甲鹽酸雙胍釋緩片 悅康藥業(yè)；RPMI 1640培養(yǎng)基 德國(guó)默克；CCK8 試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；上述試劑純度均為分析純，其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑或規(guī)格，水為超純水。

5810 系列高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德；JTMF65 膠體磨 中山市運(yùn)鴻機(jī)械有限公司；GelDoc XR Biorad 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad 公司；Waters 2695 高效液相色譜 美國(guó)沃特世；TSKgel G2000 SwXL 體積排阻色譜柱 月旭科技；HY-45 生物搖床 武漢匯誠(chéng)生物科技有限公司；2XZ-4 真空冷凍干燥機(jī) 臨海市永昊真空設(shè)備有限公司；Mco-15Ac CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司；ELx808 酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek 公司；YP20002 電子天平 上海佑科；三諾血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛膠原蛋白肽的制備 參考王杉杉等[2]的方法并稍作修改，取50 g 新鮮牦牛皮，切成面積為1×1 cm2大小，料液比為1:5 g/mL 的5%純堿浸泡8 h脫脂除雜，前處理好的牛皮選用膠體磨充分勻漿，隨后加入0.05 mol/L 的醋酸溶液，料液比為1:5 g/mL，制得牦牛皮勻漿液。牦牛皮勻漿液中加入1.5 g 胃蛋白酶，pH 調(diào)至2～3，溫度24 ℃，酶解8～12 h 后，100 ℃高溫使酶失活10 min，0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)明膠液pH 至9，加入0.3 g 堿性蛋白酶，溫度50 ℃，酶解4～6 h。酶解結(jié)束后，將酶解液100 ℃煮沸30 min，10000 r/min 離心去除殘?jiān)?.45 μm 過(guò)濾后得到膠原蛋白肽酶解液，冷凍干燥后制得牦牛膠原蛋白肽，并通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳條件：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓100 V。

1.2.2 牦牛膠原蛋白肽的分子量大小及分布 根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31645-2018 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》進(jìn)行分子量分布的檢測(cè)[13]。配制濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸（451 Da）、桿菌肽（1422 Da）、抑肽酶（6511 Da）、細(xì)胞色素C（12327 Da）以及牦牛皮膠原蛋白肽溶液，經(jīng)0.22 μm 膜過(guò)濾，待用。采用HPLC 法測(cè)定牦牛皮膠原蛋白肽分子量分布狀況，色譜條件：TSKgel G2000 SwXL，300 mm×7.8 mm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。流動(dòng)相為乙腈:水:三氟乙酸，體積比為40:60:0.05，采用100%流動(dòng)相等梯度運(yùn)行40 min，以標(biāo)準(zhǔn)品分子量對(duì)數(shù)lgMW為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間t 為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用手動(dòng)積分的方式測(cè)定不同分子量活性肽的占比。

1.2.3 動(dòng)物分組和處理 動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房（湖南師范大學(xué)），動(dòng)物房環(huán)境溫度為20～25 ℃，12 h照明/12 h 黑暗明暗交替，可自由飲水與進(jìn)食，動(dòng)物適應(yīng)一周后按體重隨機(jī)分成5 組（n=6）：正常組，模型組，牦牛膠原蛋白肽組（50 mg/kg，該濃度降血糖效果不佳未進(jìn)行后續(xù)的指標(biāo)檢測(cè)），牦牛膠原蛋白肽組（200 mg/kg），二甲雙胍組（200 mg/kg），按照文獻(xiàn)報(bào)道的糖尿病小鼠進(jìn)行造模[14?16]，禁食不禁水16 h 后，腹腔注射四氧嘧啶200 mg/kg（四氧嘧啶臨用前用生理鹽水配制），正常組注射等體積的0.9%生理鹽水，72 h 后尾部采血血糖儀測(cè)定空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L 的動(dòng)物灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)灌胃14 d，正常組和模型組給予等體積0.9%生理鹽水。

1.2.4 小鼠體重、血糖及其它血液指標(biāo)的測(cè)定 各組小鼠連續(xù)灌胃14 d，將4 組小鼠只禁食不禁水過(guò)夜，于次日早上9:00 空腹稱(chēng)量每組小鼠體重和尾部取血測(cè)定小鼠空腹血糖值[17]。末次給藥后，禁食12 h，眼球取血，分離血清，分別送至湖南師范大學(xué)校醫(yī)院進(jìn)行低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）含量的測(cè)定。

1.2.5 小鼠胰腺組織病理檢測(cè) 將小鼠處死后取胰腺組織，置于10%甲醛溶液中固定24 h，用乙醇溶液進(jìn)行脫水，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后制作組織切片（100 μm）；切片經(jīng)脫蠟水洗后，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學(xué)變化[18]。

1.2.6 牦牛膠原蛋白肽對(duì)高糖損傷INS-1 胰島細(xì)胞模型的影響 將INS-1 胰島細(xì)胞置于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，于37 ℃，飽和濕度，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將INS-1 胰島細(xì)胞進(jìn)行傳代并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/mL，均勻接種于96 孔板，每孔100 μL 培養(yǎng)24 h 后，分別設(shè)置對(duì)照組（正常培養(yǎng)基）、高糖模型組（25 mmol/L 葡萄糖）、牦牛膠原蛋白肽處理組（樣品溶解于25 mmol/L 高糖培養(yǎng)液中，用0.22 μm 的濾器過(guò)濾，分別稀釋到終濃度為0.04、0.2、1、5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組設(shè)置5 個(gè)平行。各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，按CCK8 試劑盒測(cè)定INS-1 細(xì)胞活性[19]。

細(xì)胞存活率（%）=（OD 實(shí)驗(yàn)組/OD 對(duì)照組）×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）形式表示，GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組進(jìn)行組間比較之前先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用one-way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P<0.05代表有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛膠原蛋白肽的分子量

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最高、分布最廣的功能性蛋白，在牦牛皮中以Ⅰ型膠原蛋白為主，呈現(xiàn)典型的三螺旋結(jié)構(gòu)[20]。如圖1A 所示，牦牛皮經(jīng)胃蛋白酶提取，泳道1 中，在相對(duì)分子質(zhì)量150 kDa 附近出現(xiàn)兩條泳帶，分別為α1 和α2 鏈，在相對(duì)分子質(zhì)量200 kDa 附近出現(xiàn)1 條泳帶，為β鏈，進(jìn)一步使用堿性蛋白酶酶解，在泳道2 中可見(jiàn)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被充分酶解成低分子量牦牛膠原蛋白肽，與孫愛(ài)平[3]研究的牦牛膠原蛋白提取結(jié)果相符合。根據(jù)《GB 31645—2018 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》的定義，膠原蛋白肽是指以富含膠原蛋白的新鮮動(dòng)物組織（包括皮、骨、筋、腱、鱗等）為原料，經(jīng)過(guò)提取、水解、精制生產(chǎn)的，相對(duì)分子質(zhì)量低于10000 Da（含量≥90%）的產(chǎn)品[13]。如圖1B 和表1 所示，雙酶解后牦牛膠原蛋白的分子量基本上小于細(xì)胞色素C，牦牛膠原蛋白肽分子量<10000 Da 的肽段占99.36%，說(shuō)明本研究制得的牦牛膠原蛋白肽符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 牦牛膠原蛋白肽的分子量分布Fig.1 The molecular weight distribution of yak collagen peptides

表1 牦牛膠原蛋白肽分子量分布Table 1 The molecular weight distribution of yak collagen peptides

2.2 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病小鼠的體重影響

Ⅰ型糖尿病的起始癥狀大多為“三多一少”，因胰島素的缺乏，機(jī)體不易儲(chǔ)存能量，容易引起消瘦，體重持續(xù)下降[14]。給藥的2 周期間，觀察到模型組小鼠多飲，多食，多尿，體毛松散無(wú)光澤，由表2 可知，與正常組相比，模型組小鼠體重在第7 d 和14 d 分別下降27.8%和38.4%，具有極顯著性差異（P<0.01），而二甲雙胍組和牦牛膠原蛋白肽組小鼠三癥狀均有一定程度改善。其中給藥后第7 d 和第14 d，二甲雙胍組的小鼠體重較模型組分別極顯著增加18.4%（P<0.01）和27.6%（P<0.01）；牦牛膠原蛋白肽組小鼠較模型組顯著增加7.2%（P<0.05）和21.4%（P<0.01），且第14 d 二甲雙胍組與牦牛膠原蛋白肽組小鼠之間體重?zé)o顯著差異，均起到改善小鼠體重的作用。

表2 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病模型小鼠體重影響（n=6）Table 2 Effect of yak collagen peptide on body weight of diabetic mice (n=6)

2.3 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響

據(jù)報(bào)道[9?11]，魚(yú)皮和豬皮酶解提取的膠原蛋白肽可通過(guò)提高免疫力，改善脂代謝，降低胰島細(xì)胞損傷而起到降血糖的作用。經(jīng)NCBI 序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)魚(yú)和豬的Ⅰ型膠原蛋白氨基酸序列與牦牛Ⅰ型膠原蛋白高度相似，因此，推測(cè)牦牛皮酶解產(chǎn)物同樣具有降血糖效果。如圖2 所示，小鼠糖尿病模型建立后，與正常組（NC）比較，模型組（NM）小鼠給藥第0、7 和14 d時(shí)，血糖值分別顯著升高10.6、25.1 和21.8 mmol/L（P<0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組（PM）和牦牛膠原蛋白肽組（YP-200）在給藥14 d 后，血糖含量分別顯著降低9.5 和7.7 mmol/L（P<0.05），具有明顯的降血糖效果，其中，牦牛膠原蛋白肽需灌胃14 d 以上才表現(xiàn)出顯著性差異。

圖2 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病模型小鼠的血糖影響（n=6）Fig.2 Effect of yak collagen peptide on blood sugar of diabetic mice (n=6)

2.4 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病小鼠血脂代謝的影響

機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致氧化應(yīng)激加劇，進(jìn)而對(duì)胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，造成胰島素生物活性降低，最終導(dǎo)致胰島素抵抗和高血糖的發(fā)生[21?22]。因此，血清中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的含量反應(yīng)了脂代謝絮亂程度。由表3 可知，連續(xù)灌胃給藥14 d 后，與模型組相比，牦牛膠原蛋白肽顯著降低糖尿病模型小鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）的含量（P<0.05），分別降低了14.9%、9.3%和26.5%，同時(shí)也改變了高密度脂蛋白含量但未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05），綜上表明牦牛膠原蛋白肽對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠并發(fā)的高脂血癥具一定的調(diào)節(jié)作用，與以報(bào)道的魚(yú)和豬皮提取的膠原蛋白肽具有同樣的功效[9?11]，通過(guò)改善脂代謝絮亂程度，降低糖尿病模型鼠的血糖。

表3 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL、HDL 的影響（n=6）Table 3 Effects of yak collagen peptide on serum TG,TC,LDL and HDL in diabetic mice (n=6)

2.5 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病模型小鼠胰腺的影響

正常組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整且形態(tài)規(guī)則，胰島細(xì)胞排列緊密且大小均勻，細(xì)胞質(zhì)豐富無(wú)空泡化現(xiàn)象，正常分泌胰島素足以自動(dòng)調(diào)控血糖正常代謝（圖3A）；模型組小鼠胰腺組織損傷嚴(yán)重、形態(tài)不完整，胰島細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，數(shù)目減少，有明顯空泡產(chǎn)生（圖3B）；但二甲雙胍組和牦牛膠原蛋白肽組小鼠胰腺組織形態(tài)較為完整，胰島細(xì)胞排列緊密、損傷有所減輕，空泡減少（圖3C、D）。組織形態(tài)結(jié)果觀察顯示，通過(guò)口服牦牛膠原蛋白肽對(duì)四氧嘧啶所致的小鼠胰腺的損傷具有保護(hù)和修復(fù)功能，從而起到降血糖的效果。

圖3 牦牛膠原蛋白肽對(duì)糖尿病模型小鼠胰腺組織形態(tài)的影響Fig.3 Effect of yak collagen peptide on pancreas histopathology of diabetic mice

2.6 牦牛膠原蛋白肽對(duì)高糖損傷INS-1 胰島細(xì)胞模型的影響

胰島β細(xì)胞功能受損和凋亡是糖尿病發(fā)病的主要誘因[23]，本研究中四氧嘧啶通過(guò)破壞胰島β細(xì)胞，引起血糖升高，造成小鼠糖尿病。由圖4 可知，與對(duì)照組相比，25 mmol/L 高糖模型組細(xì)胞活力顯著下降，說(shuō)明INS-1 胰島細(xì)胞高糖損傷模型構(gòu)建成功。與25 mmol/L 高糖模型組83.5%細(xì)胞活力相比，0.04、0.2 和1 mg/mL 的牦牛膠原蛋白肽的處理組細(xì)胞活力分別為87.6%、94.9%、104.5%（P<0.01），具有顯著的損傷抑制作用，其中1 mg/mL 的牦牛膠原蛋白肽抑制作用效果最佳，對(duì)高糖損傷的INS-1 胰島細(xì)胞模型具有修復(fù)作用。因此，推測(cè)在本研究中牦牛膠原蛋白肽可通過(guò)促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖和分化，增加胰島素的分泌在動(dòng)物模型中起到降血糖的效果。

圖4 牦牛膠原蛋白肽對(duì)高糖損傷INS-1 胰島細(xì)胞模型的修復(fù)作用（n=5）Fig.4 The repair effect of yak collagen peptide on the INS-1 pancreatic islet cell model damaged by high glucose（n=5）

3 討論與結(jié)論

通過(guò)四氧嘧啶成功誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型，表明以200 mg/kg 牦牛膠原蛋白肽連續(xù)灌胃給藥14 d 后能起到明顯的降血糖效果。在200 mg/kg 牦牛膠原蛋白肽的劑量下，可糾正四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型血脂代謝異常，并抑制高血糖下胰腺組織中胰島細(xì)胞損傷的機(jī)制，從而有效控制糖尿病小鼠血糖升高，減輕機(jī)體糖尿病的癥狀，與田許等[9]、王軍波等[11]和歐愛(ài)寧等[12]研究的海洋膠原蛋白肽和豬膠原蛋白肽通過(guò)改善脂代謝和提高機(jī)體免疫力從而達(dá)到降血糖相比，牦牛膠原蛋白肽具有相似的降血糖功效。本研究為牦牛膠原蛋白肽發(fā)現(xiàn)了新的功效，為后續(xù)牦牛膠原蛋白肽在降血糖藥物和輔助降血糖功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但本研究中未對(duì)牦牛膠原蛋白肽的功能成分進(jìn)行更深入研究，未明確具體降血糖的功效因子及其作用機(jī)制，以及更長(zhǎng)給藥周期下是否存在一定副作用，在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步推進(jìn)具體降血糖功效因子和不同口服劑量與給藥周期下的降血糖功效和副作用研究。