基于GC-IMS 分析不同成熟度百香果揮發(fā)性有機物的差異

羅 楊，馮 濤，王 凱，李德俊，孟憲樂，石銘亮，王 亮,

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046；2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；3.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明 650231；4.上海愛普香料集團股份有限公司，上海 201809）

百香果是一種西番蓮科植物，大量種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，果汁含量極高。其果汁顏色橙黃，芳香濃郁，具有石榴、菠蘿、香蕉、草莓、檸檬、芒果等10 余種水果的濃郁香味[1]。由于百香果具有獨特的天然香味和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，近年來越來越受到消費者喜愛，在廣西、云南等地種植面積大幅增加。百香果果實在廣西夏季成熟期是在開花后的50～60 d[2]，Araújo 等[3]研究表明百香果只有在果實表面顏色達到50%后才能收獲，以實現(xiàn)最佳的采后儲存、適當(dāng)?shù)某墒煲约疤卣黠L(fēng)味和果實品質(zhì)屬性的發(fā)展。代良超等[4]發(fā)現(xiàn)百香果的成熟度對其食品品質(zhì)有影響，熟果更加適于鮮食，品質(zhì)最好，而較熟果則需要采摘貯藏一定時間后品質(zhì)更佳。因此百香果的采摘時機對于果實的品質(zhì)及貯藏十分重要，過早或者過晚采摘果實均會對果實品質(zhì)和利用產(chǎn)生重要影響。

隨著國際市場對果品品質(zhì)要求的提高及食品工業(yè)對天然風(fēng)味物質(zhì)需求的增加，水果的風(fēng)味特別是香氣物質(zhì)研究日益受到關(guān)注。香氣成分是評價百香果果實品質(zhì)的一項重要指標(biāo)，可為果實采摘、貯藏、品種選育、加工、香料制備等提供參考[5]。大量研究表明果實中含有的揮發(fā)性成分很大程度上會受到其發(fā)育程度的影響。例如田竹希等[6]在瑪瑙紅櫻桃果實不同發(fā)育階段香氣成分的研究中，分別在綠熟期、著色期、商熟期和完熟期檢出79、77、45 和53 種香氣物質(zhì)，發(fā)育過程中相對含量最多的依次是醛類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)。徐元芬等[7]通過研究荸薺楊梅果實揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)在楊梅果實生長過程中，果實的揮發(fā)性成分含量隨著果實的成熟而降低。焦云等[8]發(fā)現(xiàn)紅肉桃在未成熟的果實中揮發(fā)性成分主要為醛類和醇類等，隨著果實的不斷成熟，醛類和醇類下降，芳樟醇含量明顯升高。有報道表明不同成熟度百香果的食用品質(zhì)存在一定的差異[4,9?10]，但是針對揮發(fā)性香氣成分的研究目前并不多見。

水果香氣物質(zhì)分析中，GC-MS[11]、GC-O-MS[12]是較常用的方法。在GC-MS 或GC-O-MS 分析過程中，需要對樣品進行預(yù)處理，涉及加熱、蒸餾、萃取等過程，操作繁瑣，消耗的樣品量大，且容易造成有機溶劑殘留[13]。而且這兩種方法的樣品預(yù)處理過程可能破壞水果原有的一些香氣成分，另外前處理或檢測時間過長也可能會導(dǎo)致測定結(jié)果不夠及時和準(zhǔn)確[14]。氣相-離子遷移譜技術(shù)（GC-IMS）是一種新型分析技術(shù)，近年來被廣泛應(yīng)用于食品[15]、中藥[16]等樣品中揮發(fā)性有機物風(fēng)味分析，以及環(huán)境VOCs 監(jiān)測[17]、呼氣醫(yī)療[18]等領(lǐng)域。GC-IMS 采用頂空進樣分析低溫常壓且易揮發(fā)性成分，無需富集濃縮，檢出可以最大限度的保留樣品的氣味，而且二次分離得三維數(shù)據(jù)，可實現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)可視化。與GC-MS 相比，具有數(shù)據(jù)處理省時省力，快速得到樣品報告，檢測方式簡單且結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)勢，能夠快速捕捉檢測樣品最真實的風(fēng)味[19]。然而目前采用GC-IMS 分析不同成熟度百香果中揮發(fā)性有機物的研究尚未見報道。

因此，本研究利用GC-IMS 技術(shù)對百香果不同成熟度（花后50 d 果和花后60 d 果）果實進行揮發(fā)性成分分析，闡明不同成熟度百香果中的揮發(fā)性成分及其差異，以期為百香果果實的采摘時機、貯藏、品質(zhì)控制及后續(xù)利用提供依據(jù)，同時也可以為其他水果的風(fēng)味物質(zhì)的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百香果：A 果（無綠果），于花后60 d 采摘，果皮表面100%紫色；B 果（1/4 綠色果），于花后50 d 采摘，果皮表面75%紫色、25%綠色 廣西桂平市匯鑫百香果種養(yǎng)專業(yè)合作社。

FlavourSpec1H1-00053 型頂空氣相-離子遷移譜儀 德國G.A.S.公司；CTC CombiPAL 頂空自動進樣器 瑞士 CTC Analytics AG 公司；CLOT 毛細管柱（15 m×0.25 mm×0.50 μm） 德國CS-Chromatographie Service GmbH。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 打開百香果，取百香果果籽和果汁共1.5 g，裝入20 mL 頂空瓶中，50 ℃孵育15 min后進樣，進行數(shù)據(jù)分析。每個樣品取3 次作為平行。

1.2.2 GC-IMS 分析條件 自動頂空進樣單元：進樣體積200 μL；孵育時間15 min；孵育溫度50 ℃；進樣針溫度85 ℃；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；

氣相-離子遷移譜單元：分析時間30 min；色譜柱類型為FS-SE-54-CB-1 15 m ID：0.53 mm；柱溫60 ℃；載氣/漂移氣為N2；IMS 溫度45 ℃；離子遷移管漂移器中以150 mL/min 流速吹氣30 min。

氣相色譜條件：以N2為載氣，0～10 min 流速為2 mL/min，10～20 min 流速為10 mL/min，20～30 min流速為100 mL/min，最終流速升至150 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用GC×IMS Library Search V 2.2.1 分析軟件、內(nèi)置NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫，對樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行定性分析，結(jié)合Reporter 插件、Gallery Plot 插件和Dynamic PCA 插件采用LAV（laboratory analytical viewer）對樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后進行定量分析，根據(jù)指紋圖譜對比，直觀地比較兩種成熟度不同的百香果樣品之間的揮發(fā)性有機物差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接比較不同成熟度百香果中的揮發(fā)性有機物差異

根據(jù)保留時間、遷移時間和峰強度，利用Reporter 軟件，分別得到三維圖圖1 和俯視圖圖2。在圖1 離子遷移譜圖中，橫坐標(biāo)1.0 處紅色峰為RIP 峰（反應(yīng)離子峰），為反應(yīng)提供質(zhì)子和電子，峰的高度即峰強度。在圖2 中，RIP 峰兩側(cè)，每一個點代表了一種揮發(fā)性物質(zhì)，顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深代表濃度越大。由兩個圖可以直觀地看出，不同成熟度的百香果中的揮發(fā)性物質(zhì)存在差異。

圖1 不同成熟度百香果中揮發(fā)性有機物的GC-IMS 三維譜圖Fig.1 Three-dimensional GC-IMS spectra of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

圖2 不同成熟度百香果中揮發(fā)性有機物的GC-IMS 二維譜圖Fig.2 Two-dimensional GC-IMS spectra of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

為了更直觀地對比這種差異，可采用GC-IMS插件中的差異模式進行對比。圖3 中，選取百香果A 果的譜圖作為參比，用百香果B 果的譜圖扣減參比。如果二者揮發(fā)性有機物一致，則扣減后的背景為白色，而紅色代表該物質(zhì)的濃度高于參比，藍色代表該物質(zhì)的濃度低于參比。點的顏色深淺反映成分含量的多少，點的顏色越紅，則該組分的含量越多。通過圖3 可以更加明顯地看出，不同成熟度的百香果中的揮發(fā)性有機物存在差異，且A 中揮發(fā)性有機物的含量總體更高。

圖3 不同成熟度百香果中揮發(fā)性有機物GC-IMS二維差異對比譜圖Fig.3 Comparison of differences in two dimensional GC-IMS spectra of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

2.2 不同成熟度百香果中的揮發(fā)性有機物指紋圖譜對比

為了進一步明確不同成熟度的百香果中具體哪些物質(zhì)存在差異，實驗選取百香果A 和B 樣品中所有峰進行指紋圖譜對比，結(jié)果見圖4。圖4 中，每一行代表一個百香果樣品中選取的全部信號峰，每一列代表同一揮發(fā)性有機物在不同百香果樣品中的信號峰。有一部分揮發(fā)性化合物由于具有較高濃度等原因，會形成單體（M）、二聚體（D）和多聚體（P）等不同形式，并且會出現(xiàn)相對應(yīng)的遷移峰（圖4）。從圖4 中可以看到在百香果A 果和B 果的完整揮發(fā)性有機物信息以及A、B 之間揮發(fā)性有機物的差異：紅框中的物質(zhì)在百香果A 中的含量更高，包括DL-2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、2-戊酮、乙酸丁酯、2-庚酮、α-蒎烯、（E,E）-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、檸檬烯、β-羅勒烯、2-丁酮、丁酸甲酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯等；黃框中的物質(zhì)在百香果B 中的含量更高，包括乙酸異戊酯和乙酸異丁酯等。郭艷峰等[20]通過SPME-GCMS，對不同發(fā)育階段的百香果果汁揮發(fā)性成分進行定性定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段百香果果汁揮發(fā)性成分存在一定重復(fù)性，但是在某些成分上，隨著果實的成熟，不同發(fā)育階段的果實的果汁揮發(fā)性成分有著明顯不同，這一結(jié)論也與本次實驗結(jié)果相符。

圖4 不同成熟度百香果中揮發(fā)性有機物的Gallery Plot 圖Fig.4 Gallery Plot of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

通過GC-IMS 獲取百香果揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上，利用PCA 統(tǒng)計學(xué)對百香果A 果和百香果B 果進行分析，使用Dynamic PCA 插件分析結(jié)果見圖5。從圖5 可知，PC-1 和PC-2 的方差貢獻率分別為85%和8%，累計方差貢獻達93%，遠大于可信值60%以上，因此PC-1 和PC-2 足以反映不同百香果樣品之間的差異。在PCA 分析圖中，樣品之間距離近則代表差異小，距離遠則代表差異明顯。從圖5 可以看出，同一樣品三個平行組中的差異較小，而不同成熟度百香果A 和B 中的揮發(fā)性有機物存在明顯差異，A 果樣品主要聚集于正X 軸方向，而B果樣品主要位于負X 軸方向。因此，通過GC-IMS結(jié)果結(jié)合PCA 分析，能夠方便快捷地對不同百香果樣品進行區(qū)分。此外，本方法也為儲存和加工應(yīng)用等提供一定的參考依據(jù)。

圖5 不同成熟度百香果的主成分分析（PCA）圖Fig.5 PCA diagrams of passion fruit with different maturity

此外，本實驗采用最新指紋分析方法——“最近鄰”指紋相似度，“最近鄰”功能可根據(jù)所選評估區(qū)域中化合物的強度對A、B 兩種成熟度的百香果樣品進行快速比較（圖6）。圖6 中，左邊紅色區(qū)域和右邊藍色區(qū)域分別代表樣品B 果和樣品A 果揮發(fā)性物質(zhì)出峰點的動態(tài)范圍，每個樣品進三次平行進樣A1、A2、A3 和B1、B2、B3 表示每次平行試驗的出峰點，頂部灰色線條代表每一針樣品的相似度，出峰點越靠近灰色顏色越深，說明重復(fù)性好；越遠灰色顏色越淺，說明重復(fù)性越差。從圖6 可以看到B 樣品的重復(fù)性比A 樣品的重復(fù)性更好一些。盧健平[21]發(fā)現(xiàn)果實采摘后在儲藏期間存在一個后熟階段，后熟期間，水果呼吸作用旺盛，在此期間果實體內(nèi)的有機物能繼續(xù)水解，對風(fēng)味和生理特性的變化產(chǎn)生莫大的影響。因此推測造成A 樣品重復(fù)性不太好的原因可能是A 果為60 d 果，熟果在運輸過程中生化反應(yīng)更活躍，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)更容易發(fā)生變化[22]。但是，A 果和B 果兩個樣品之間的相似度低，表明兩種不同成熟度的百香果之間的揮發(fā)性有機物存在明顯差異。

圖6 不同成熟度百香果的“最近鄰”指紋分析Fig.6 "Nearest Neighbor" fingerprint analysis of passion fruit with different maturity

2.3 百香果中的揮發(fā)性有機物定性分析（GC×IMS Library Search）

在圖2 中，GC-IMS 二維譜圖反映了A、B 樣品中每種揮發(fā)性物質(zhì)遷移點。在此基礎(chǔ)之上，結(jié)合軟件內(nèi)置的NIST 和IMS 數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性成分進行定性分析，可進一步得到揮發(fā)性有機物離子遷移譜圖（圖7）。在圖7 中，橫坐標(biāo)代表遷移時間，縱坐標(biāo)代表保留時間，每一個點根據(jù)其對應(yīng)的二維數(shù)據(jù)完成定性，一個點代表一種有機物，百香果揮發(fā)性成分定性分析結(jié)果見表1。

圖7 不同成熟度百香果的揮發(fā)性成分特征峰位置點圖Fig.7 Characteristic peak location point of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

表1 所有物質(zhì)的保留指數(shù)、遷移時間和峰體積Table 1 Retention index,migration time and peak volume data of all substances

通過GC-IMS library 數(shù)據(jù)庫的定性，在A、B 兩種成熟度的百香果中共鑒定出33 種揮發(fā)性化合物。韓素芳等[23]利用HS-SPME-GC-MS 共鑒定出百香果中的39 種香氣成分；潘葳等[24]在“滿天星”百香果中共鑒定出39 種香氣成分；袁源等[25]通過頂空固相微萃取方法對百香果粉進行風(fēng)味分析最后測定出23 種主要揮發(fā)性化合物；劉純友等[26]對三種類型百香果進行揮發(fā)性風(fēng)味成分測定，結(jié)果共鑒定出32 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，主要包括酯類12 種、烯烴類7 種、烷烴類2 種、醇類8 種、酮類3 種，其中共有成分有16 種。在本研究中，從A 果中檢測并定性出29 種揮發(fā)性化合物，其中醇類2 種，占10.44%；醛類2 種，占1.11%；酯類11 種，占79.51%；酮類2 種，占6.07%；萜烯類3 種，占2.88%（表1）。在B 果中檢測并定性出15 種揮發(fā)性化合物，其中只有2 種醇類，占18.76%；8 種酯類，占81.24%。兩種成熟度的百香果中酯類和醇類的含量都相對很高（表1）。本研究結(jié)果與前期采用GC-MS 報道的結(jié)果基本一致，部分差異之處可能是由于百香果品種不同的原因或者采用的分析分析儀器不同。采用GC-IMS 進行香氣成分分析，可以實現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)的可視化，通過與PCA 結(jié)合則可以快速實現(xiàn)不同樣品的區(qū)分，因此近年在食品風(fēng)味分析中的受關(guān)注度越來越高。另外，本研究中尚有36 個離子遷移峰被充分分離但未被鑒定（圖4），隨著GC-IMS Library 數(shù)據(jù)庫的日益完善，該方法在揮發(fā)性成分分析中的應(yīng)用也將更加準(zhǔn)確高效。

在有關(guān)水果香氣物質(zhì)的研究中，郭艷峰等[27]和Janzantti 等[28]研究發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)對水果的香氣起到了重要作用，是主要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。此外，Porto-Figueira 等[29]發(fā)現(xiàn)酯類為9 種百香果鮮果揮發(fā)性物質(zhì)中最主要成分，品種間揮發(fā)性化合物圖譜存在差異。酯類具有果香型的感官特征，是果實中重要的特征芳香物質(zhì)[30]，由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的游離脂肪酸與醇之間相互作用生成[31]。Macoris 等[32]在百香果中分離檢測到77 種化合物，其中以丁酸甲酯、乙酸丁酯、己醛、丁酸丁酯、反式-3-己烯乙酸酯、順式-3-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯等酯類為主要揮發(fā)性化合物。此外，醇類通常具有清香型的感官特征[33]，百香果醇類和酯類是形成百香果獨有香韻的關(guān)鍵物質(zhì)。本研究中，百香果花后60 d 果（A 果）和花后50 d 果（B 果）中共同檢測到的揮發(fā)性化合物為芳樟醇、己酸甲酯、戊酸乙酯、丙酸乙酯，酯類香氣成分與上述報道結(jié)果基本一致，但是鑒定出的醇類物質(zhì)數(shù)量較少，可能部分未鑒定的揮發(fā)性化合物中存在醇類物質(zhì)。

Zhu 等[34]發(fā)現(xiàn)水果在成熟過程中風(fēng)味的變化很大程度上受到乙烯的影響，研究發(fā)現(xiàn)造成百香果在不同階段揮發(fā)性成分含量不同的原因在于隨著果實不斷發(fā)育，其體內(nèi)的糖類、脂肪酸、乙烯釋放量、脂氧合酶、醇脫氫酶和醇?；D(zhuǎn)移酶等代謝相關(guān)酶活性均會發(fā)生變化，進而對果實揮發(fā)性物質(zhì)造成影響[35]。隨著百香果不斷成熟，糖苷鍵被酶水解釋放出游離的揮發(fā)性成分[36]從而使得百香果成熟后香氣怡人。基于本研究中的實驗結(jié)果，可以看出百香果成熟果A 果中檢測出的揮發(fā)性成分多于B 果，且有3 類獨特的揮發(fā)性成分，為醛類、酮類、萜烯類，說明隨著果實的不斷成熟，其體內(nèi)的醛類、酮類、萜烯類香氣物質(zhì)不斷增多，由此可將這類化合物是否被檢測出作為區(qū)別百香果果實處于何種成熟度的一種判斷依據(jù)。

3 結(jié)論

百香果富含眾多香氣物質(zhì)，研究表明百香果的果香味和甜味主要是由于其體內(nèi)存在許多酯類、醛類物質(zhì)。本實驗利用氣相-離子遷移譜技術(shù)對不同成熟度的百香果中揮發(fā)性有機物進行快速定性和差異分析，經(jīng)過GC-IMS 分析后，發(fā)現(xiàn)在兩個樣品中共鑒定出33 種揮發(fā)性有機物組分，其中醇類、酯類化合物為百香果的主要揮發(fā)性成分。同時實驗結(jié)果表明不同成熟度百香果中的揮發(fā)性有機物存在明顯差異，成熟度更高的百香果中檢測到獨有的醛酮類、萜烯類化合物。實驗結(jié)果表明，GC-IMS 可以作為檢測百香果中揮發(fā)性成分的一種操作簡單、高效且可靠的方法，成熟果中檢測到獨有的醛類、酮類、萜烯類物質(zhì)，該結(jié)果可以作為區(qū)別不同成熟度百香果的一個判斷指標(biāo)，同時為百香果果實采摘、貯藏、加工等開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)，為分析和對比其他水果的揮發(fā)性成分提供一種高效快速的檢測方法。