低聚半乳糖對植物乳桿菌發(fā)酵乳特性及抗蠟樣芽孢桿菌活性的改善

劉 樂，鄒開翔，邵開生，于 暉，陶雪瑩，魏 華,3，張志鴻,3,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047；2.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌 330029；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330047）

益生乳酸菌因具有調(diào)節(jié)宿主健康并改善發(fā)酵食品風(fēng)味的特點而得到廣泛的應(yīng)用[1?2]。乳制品作為乳酸菌應(yīng)用最常規(guī)的載體[3?4]，具有為乳酸菌提供保護劑的功能，同時可以為菌株發(fā)酵提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。乳酸菌代謝產(chǎn)生的代謝物，如乳糖酶和蛋白分解酶，可分別分解牛奶里的乳糖和蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生有機酸等小分子代謝產(chǎn)物，有利于人體消化吸收[5?7]。

植物乳桿菌ZDY2013 是一株分離于自然發(fā)酵酸豆角中，且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)勢菌株，具有耐受胃腸道環(huán)境并調(diào)節(jié)宿主腸道菌群的能力[8?9]。前期研究表明，植物乳桿菌ZDY2013 展現(xiàn)了良好乳制品發(fā)酵劑的作用，能用于牛奶發(fā)酵，并能抑制污染各類乳制品的食源致病蠟樣芽孢桿菌在發(fā)酵過程中的生長[10]，同時該菌發(fā)酵的牛奶可有效預(yù)防由產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌引起的腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡[11]。因此，該植物乳桿菌應(yīng)用于乳制品生產(chǎn)將有效防止發(fā)酵乳被該致病菌污染，從而提升發(fā)酵乳的安全性。

低聚半乳糖（Galactooligosaccharide，GOS）是一類腸道微生物可獲得性碳水化合物（Microbiotaaccessible carbohydrate，MAC），能不被腸道消化吸收，直接進入大腸供腸道固有乳酸菌代謝使用，具有益生元特性[12?13]。研究表明，低聚半乳糖在動物的乳汁中有微量的存在，而人母乳中含量相對較多[14]，被認為是一種乳源性功能低聚糖，可以改善腸道菌群的穩(wěn)定性，為嬰幼兒健康發(fā)育不可或缺的成分[15?16]。研究發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖可以降低多種類型腹瀉疾病的風(fēng)險，包括旅行者腹瀉、滲透性腹瀉和艱難梭菌相關(guān)復(fù)發(fā)性腹瀉[17?19]，還可以通過改善優(yōu)勢益生菌屬的定植來達到促進腸道健康，進而預(yù)防炎癥性腸病以及便秘等[20?22]的目的。

目前，低聚半乳糖主要應(yīng)用于嬰兒配方奶粉、糕點、面包等。據(jù)報道，添加低聚半乳糖在奶粉中可促進宿主體內(nèi)雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌的生長[13]；攝入添加了低聚半乳糖的酸奶能夠提高腸道菌群的豐度、短鏈脂肪酸的產(chǎn)量以及鈣的利用率[23]。因此，開發(fā)兼具益生菌和益生元功能，或協(xié)同功能的乳制品是豐富該領(lǐng)域產(chǎn)品的有效策略。為此，本文在確定低聚半乳糖能促進植物乳桿菌ZDY2013 體外代謝的基礎(chǔ)上，進一步采用響應(yīng)面法分析多種因素對發(fā)酵乳特性的影響，并考察低聚半乳糖對植物乳桿菌發(fā)酵乳抑制食源性產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的改善作用。本研究將為低聚半乳糖在發(fā)酵乳中的應(yīng)用，及植物乳桿菌ZDY2013 的功能開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZDY2013、產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）HN001 均保存于食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室；葡萄糖、低聚半乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、MRS 培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；氯化銨、四水硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、半胱氨酸鹽酸鹽、七水硫酸鎂、吐溫-80 西隴化工股份有限公司；其他有機試劑均為國產(chǎn)分析純。

Anaerobox IV 型厭氧培養(yǎng)箱 美國Gene Science公司；ZXSD-B1090 型恒溫培養(yǎng)箱 中國上海智城分析儀器有限公司；ST 16R 型臺式高速冷凍離心機德國Eppendorf 公司；MultiskanGO 型全波長酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司；PHS-3E 型pH計中國上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 MRS 培養(yǎng)基：稱取48 g MRS培養(yǎng)基粉末，加蒸餾水溶解并定容至1 L，錐形瓶分裝，121 ℃高溫滅菌15 min；LB 培養(yǎng)基：稱取NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、加蒸餾水溶解并定容至1 L，121 ℃高壓滅菌15 min；Basal MRS（BMRS）培養(yǎng)基[24]：稱取胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化銨3.0 g、四水硫酸鎂0.05 g、磷酸氫二鉀4.0 g、磷酸二氫鉀2.6 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、七水硫酸鎂0.102 g 和吐溫-80 1.0 g，加去離子水至1 L，溶解并調(diào)pH 至6.2±0.1，于121 ℃滅菌15 min。BMRS 用于后續(xù)改良培養(yǎng)基的配制。

1.2.2 菌株活化 從?80 ℃冰箱取出植物乳桿菌ZDY2013，在MRS 固體培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h，將單菌落挑至5 mL 液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h，以1.0% （v/v）接種量傳代兩次，使得菌液濃度為1.5×109CFU/mL。蠟樣芽孢桿菌HN001 需在LB 固體培養(yǎng)基上劃線，并傳代至5 mL LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h。

1.2.3 低聚半乳糖對植物乳桿菌生長的影響 在BMRS 培養(yǎng)基中添加無菌的低聚半乳糖或者葡萄糖溶液，使其終濃度為2.0%（v/v），獲得不同改良MRS 培養(yǎng)基，其中葡萄糖組作為對照組。取上述活化后的菌液以1.0%（v/v）接種到改良培養(yǎng)基中，于37 ℃條件靜置厭氧培養(yǎng)，從2 h 開始，每隔2 h 取樣一次，進行活菌計數(shù)。pH 測定：取上述傳代兩次后的菌液1.0%（v/v），添加到含有2.0%葡萄糖或低聚半乳糖的改良MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2 h 取一次，測量其pH。

1.2.4 植物乳桿菌發(fā)酵液的抑菌活性測定 將上述活化后的植物乳桿菌以1.0%（v/v）接種到添加了葡萄糖或低聚半乳糖（2.0%，w/v）的改良MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h，于8000×g 離心10 min，發(fā)酵上清液備用。將上述活化后的蠟樣芽孢桿菌HN001 按1%（v/v）的接種量接種至5 mL LB 培養(yǎng)中，在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h，再用1×PBS 對培養(yǎng)液進行10 倍稀釋，后取100 μL 涂布到LB 固體培養(yǎng)基上，待菌液晾干后，加入上述150 μL植物乳桿菌發(fā)酵上清液于牛津杯，靜置20 min，37 ℃培養(yǎng)12 h，記錄抑菌圈直徑。

1.2.5 不同發(fā)酵條件對低聚半乳糖發(fā)酵乳特性的影響

1.2.5.1 單因素實驗設(shè)計 a.菌株接種量：以接種量0.5%、1.0%、2.0%和3.0% （v/v）的植物乳桿菌重懸液分別接種至已滅菌的10%的脫脂乳（含1.0%的葡萄糖或低聚半乳糖）中，在37 ℃下靜置發(fā)酵24 h，測定發(fā)酵乳中植物乳桿菌的活菌數(shù)、pH 和持水力；b.低聚半乳糖濃度：配制含0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的葡萄糖或低聚半乳糖的10%的脫脂乳，再接種1.0%的植物乳桿菌重懸液，于37 ℃條件下發(fā)酵24 h，測定發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)、pH 和持水力；c.發(fā)酵時間：以接種量為1.0%的植物乳桿菌重懸液接種至已滅菌的10%的脫脂乳（含1.0%的葡萄糖或低聚半乳糖）中，在37 ℃條件下分別發(fā)酵6、12、24 和48 h，測定發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)、pH 和持水力；d.發(fā)酵溫度：以接種量為1.0%的植物乳桿菌重懸液接種至已滅菌的10%的脫脂乳（含1.0%的葡萄糖或低聚半乳糖）中，分別在27、32、37、42 ℃條件下靜置發(fā)酵24 h，測定發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)、pH 和持水力。

1.2.5.2 發(fā)酵乳特性的測定 a.活菌數(shù)：用1×PBS對發(fā)酵乳樣品進行10 倍梯度稀釋，接著在MRS 固體培養(yǎng)基上涂板，于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h，計算活菌數(shù)；b.pH：用PHS-3E 型pH 計測定不同條件下發(fā)酵乳樣品的pH；c.持水性：稱取發(fā)酵乳樣品5 g（M0），在5000×g，4 ℃下離心15 min，除去上清后再稱重（M1）。發(fā)酵乳持水力計算公式如下：持水力（%）=（M1/M0）×100。

1.2.6 響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵乳制備條件 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以植物乳桿菌活菌數(shù)為響應(yīng)值，以菌液接種量（X1）、糖添加質(zhì)量濃度（X2）、發(fā)酵時間（X3）、發(fā)酵溫度（X4）為考察指標，利用Designexpert 8.0.6 軟件設(shè)計四因素三水平試驗，其中Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.7 低聚半乳糖發(fā)酵乳的抑菌活性 參考前期研究方法[10]，在含有1.0%低聚半乳糖的10%脫脂乳粉溶液中接種產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌HN001，使其終濃度為103CFU/mL，模擬較低濃度的污染，再接種植物乳桿菌ZDY2013 至其終濃度為105CFU/mL，靜置培養(yǎng)。分別在0、24、36 和48 h 取發(fā)酵液1.0 mL，用1×PBS 進行10 倍梯度稀釋，在MRS 固體平板上進行涂布，計算活菌數(shù)。試驗進行三次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實驗均重復(fù)三次，結(jié)果用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。采用GraphPad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，各組總體均數(shù)采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）進行顯著性比較，其中P<0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚半乳糖對植物乳桿菌體外代謝的影響

根據(jù)前期植物乳桿菌ZDY2013 全基因組測序結(jié)果，可知其具有代謝多種碳水化合物的相關(guān)酶[25]。本研究采用低聚半乳糖制作改良MRS，評價植物乳桿菌ZDY2013 體外發(fā)酵特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種量為1.0%的植物乳桿菌能很好的利用低聚半乳糖進行代謝，生長能力類似碳源為葡萄糖的對照組（圖1A）。其中，前4 h 為代謝調(diào)整期，植物乳桿菌利用兩種碳源代謝的濃度變化較少；在4～10 h 間為指數(shù)生長期，細菌濃度能達到109CFU/mL；在10 h 之后為代謝穩(wěn)定期，低聚半乳糖組的植物乳桿菌濃度要高于葡萄糖組，且在第22 h 時有顯著差異（P<0.05），說明低聚半乳糖在促進植物乳桿菌代謝方面要優(yōu)于葡萄糖。另外，植物乳桿菌代謝兩種不同碳水化合物后發(fā)酵液的pH 變化趨勢非常相似（圖1B）。其中，前4 h 的pH 變化均不明顯，4～12 h 后pH 急速下降，與菌株代謝的濃度結(jié)果基本一致，隨后pH 慢慢趨于穩(wěn)定并維持在3.8 左右，說明植物乳桿菌利用低聚半乳糖代謝能力較強，能降低發(fā)酵液pH，這和前期研究發(fā)現(xiàn)的植物乳桿菌ZDY2013 利用商業(yè)化MRS 代謝產(chǎn)酸降低pH 結(jié)果一致[10]。綜上所述，植物乳桿菌ZDY2013可以利用具有益生元特性的低聚半乳糖進行良好生長代謝。

圖1 低聚半乳糖對植物乳桿菌ZDY2013 生長代謝的影響Fig.1 Effect of GOS on the metabolism of L.plantarum ZDY2013

2.2 低聚半乳糖對植物乳桿菌發(fā)酵上清液抑菌能力的影響

植物乳桿菌代謝碳水化合物發(fā)揮抗菌活性對其在食品中的開發(fā)應(yīng)用具有重要意義。本研究采用食品中可引起嘔吐和腹瀉食源性疾病的蠟樣芽孢桿菌作為指示菌[26]，考察植物乳桿菌發(fā)酵低聚半乳糖后上清的抑菌能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌利用改良培養(yǎng)基發(fā)酵后的上清對產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌HN001 具有良好的抑制作用，抑菌圈均在10 mm 以上，且低聚半乳糖組的抑菌效果優(yōu)于對照的葡萄糖組（圖2）。上述結(jié)果與前期植物乳桿菌利用MRS 培養(yǎng)基發(fā)酵上清的抑菌效果相似，說明采用低聚半乳糖改良的培養(yǎng)基進行發(fā)酵也產(chǎn)生了能抑菌的有機酸[10]。

圖2 植物乳桿菌利用改良培養(yǎng)基發(fā)酵的抑菌能力Fig.2 The antibacterial ability of L.plantarum fermented with modified media

2.3 影響低聚半乳糖發(fā)酵乳特性的因素

2.3.1 不同菌液接種量對發(fā)酵乳特性的影響 植物乳桿菌作為乳品發(fā)酵菌劑，對發(fā)酵乳的特性具有決定性的影響作用。在低聚半乳糖添加量一定的條件下，乳品中接種不同比例的植物乳桿菌菌液對發(fā)酵乳中活菌數(shù)有一定的影響，表現(xiàn)為隨著接種量的升高（0.5%～3.0%），最終活菌數(shù)不斷提高，且最高濃度達8.9 lg CFU/mL，與接種量為0.5%時，有高度顯著差異（P<0.001；圖3A）；然而，葡萄糖添加量一定時，乳品中接種不同比例的植物乳桿菌菌液對發(fā)酵乳中活菌數(shù)沒有特別的影響（均低于8.6 lg CFU/mL），這可能是因為1.0%（m/v）葡萄糖濃度較低，難以促使植物乳桿菌在發(fā)酵乳中高效生長，這也說明接種高濃度植物乳桿菌時，低聚半乳糖相比葡萄糖更有利于提高發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)。與發(fā)酵乳中活菌數(shù)變化相對應(yīng)的是，當乳品中添加一定量低聚半乳糖時，發(fā)酵乳pH 隨菌液接種量升高而降低（圖3B），這主要是由于發(fā)酵液中高濃度活菌會產(chǎn)生更多的有機酸，從而導(dǎo)致發(fā)酵乳的pH 高度顯著下降（P<0.001）。類似地，葡萄糖對照組pH 也不斷下降，推測可能是由高含量接種量促使植物乳桿菌快速進入穩(wěn)定期，并不斷積累有機酸導(dǎo)致的。發(fā)酵乳的持水力體現(xiàn)了發(fā)酵乳體系對水的截留能力，與其微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)[27]，影響發(fā)酵乳的品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)當接種較高濃度的植物乳桿菌時，葡萄糖組的發(fā)酵乳持水力比較差（75%），這可能與菌株在發(fā)酵乳中過早進入穩(wěn)定期，并不斷積累有機酸影響發(fā)酵乳的滲透壓有關(guān)；而低聚半乳糖組未發(fā)生此類現(xiàn)象，接種量變化不會影響發(fā)酵乳較高的持水力（圖3C），這可能是低聚糖更有利于發(fā)酵乳中酪蛋白生成，從而在酸性的環(huán)境下相互作用形成三維空間膠體結(jié)構(gòu)，包容更多的水分子[24,28]。綜上，說明添加了低聚半乳糖的發(fā)酵乳對菌液接種量變化的適應(yīng)性更佳，且當菌液接種量為2%或3%時，更有利于改善發(fā)酵乳的特性。

圖3 不同菌液接種量對植物乳桿菌發(fā)酵乳特性的影響Fig.3 Effect of different inoculation amount on the characterization of L.plantarum fermented milk

2.3.2 不同低聚半乳糖濃度對發(fā)酵乳特性的影響低聚半乳糖是一種具有優(yōu)良益生元特性的功能低聚糖，其能被腸道內(nèi)乳酸菌所利用，開發(fā)含有益生元的發(fā)酵乳制品具有重要意義。由前面結(jié)果已知，低聚半乳糖能促進植物乳桿菌在發(fā)酵乳中的代謝，為此進一步探究不同濃度的低聚半乳糖添加量對發(fā)酵乳特性的影響。從圖4A 結(jié)果可知，發(fā)酵乳中糖添加濃度的變化對植物乳桿菌活菌數(shù)無明顯影響，但低聚糖組的活菌數(shù)均高于葡萄糖組，其中添加濃度為1.0%～4.0%時，有顯著差異（P<0.05），這主要是因為低聚半乳糖在發(fā)酵乳中更有利于促進植物乳桿菌生長，從而提高了其在穩(wěn)定期的濃度；由圖4B 可知，隨著糖濃度的增加，pH 有下降趨勢，且低聚半乳糖組的pH 均低于葡萄糖組，在糖濃度為1.0%～4.0%時有高度顯著差異（P<0.001），結(jié)合圖4A，說明隨著糖濃度的升高，植物乳桿菌在發(fā)酵乳中產(chǎn)有機酸的能力變強。另外，當?shù)途郯肴樘菨舛葹?.0%時，pH 低于4.5，將有利于抑制發(fā)酵食品中病原微生物的繁殖。由圖4C 可知，隨著糖濃度的增加，發(fā)酵乳的持水力有上升的趨勢，但是低聚半乳糖組與葡萄糖對照組均無顯著差異（P>0.05），說明糖濃度不是發(fā)酵乳持水力變化的決定因素。綜上所述，不同濃度的糖對發(fā)酵乳特性有一定的影響，且糖質(zhì)量濃度超過1.0%時優(yōu)于葡萄糖。

圖4 不同濃度低聚半乳糖對植物乳桿菌發(fā)酵乳特性的影響Fig.4 Effect of different concentration of GOS on the characterization of L.plantarum fermented milk

2.3.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵乳特性的影響 乳酸菌發(fā)酵時間長短的選擇對發(fā)酵食品質(zhì)量控制至關(guān)重要。如圖5A 所示，發(fā)酵結(jié)束時間的不同，發(fā)酵乳中的植物乳桿菌活菌數(shù)是有差異的，尤其是發(fā)酵6 h 結(jié)束時，活菌濃度均不及108CFU/mL，只有發(fā)酵12 h 后，低聚半乳糖組的菌株開始進入生長穩(wěn)定狀態(tài)，且低聚半乳糖和葡萄糖組之間沒有顯著差異（P>0.05）。然而，低聚半乳糖和葡萄糖組在發(fā)酵24 h時，pH 有顯著差異（P<0.05），整體上發(fā)酵乳pH 隨發(fā)酵時間的延長而不斷下降，這主要是活菌在發(fā)酵乳中快速代謝，積累有機酸導(dǎo)致的，且在24 h 后pH降到5.0 以下，能有效預(yù)防病原微生物污染。另外，發(fā)酵乳持水力在發(fā)酵前12 h 很強，無論低聚半乳糖組還是葡萄糖組均超過85%，而發(fā)酵24 h 之后會降低并趨于平穩(wěn)（圖5C）。綜上，說明發(fā)酵24 h 為發(fā)酵乳綜合特性最適時間。

圖5 發(fā)酵時間對植物乳桿菌發(fā)酵乳特性的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the characterization of L.plantarum fermented milk

2.3.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳特性的影響 發(fā)酵溫度是影響乳酸菌發(fā)酵乳品質(zhì)的另一個因素，因此評估植物乳桿菌發(fā)酵的最適溫度有重要意義。根據(jù)植物乳桿菌的最適生長溫度為37 ℃的特點，本研究選擇27、32、37 和42 ℃溫度指標來探究發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳特性的影響。由圖6A 可知，發(fā)酵溫度為27～37 ℃時，發(fā)酵乳最終活菌濃度較高，接近109CFU/mL；而溫度為42 ℃時，對發(fā)酵乳最終活菌數(shù)有一定影響，但濃度也高于108CFU/mL。另外，由圖6B 可知，不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳pH 影響不大，這主要取決于發(fā)酵乳中活菌數(shù)和發(fā)酵時間的影響，和圖6A 結(jié)果相似。此外，從圖6C 可知，發(fā)酵溫度變化對發(fā)酵乳的持水力影響也不明顯，且只有當發(fā)酵溫度在37 ℃時，低聚半乳糖組的持水力顯著高于葡萄糖組（P<0.05）。綜上，發(fā)酵溫度在一定范圍內(nèi)變化對發(fā)酵乳特性影響不大，說明該發(fā)酵乳的制備對溫度要求不太苛刻。

圖6 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌發(fā)酵乳特性的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the characterization of L.plantarum fermented milk

2.4 植物乳桿菌與低聚半乳糖在牛奶中發(fā)酵的條件優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken 試驗結(jié)果與分析 發(fā)酵乳中活菌數(shù)為影響發(fā)酵乳特性的最主要因素，其可以影響發(fā)酵乳的pH 和持水性。因此，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵乳活菌數(shù)為響應(yīng)值，以影響發(fā)酵乳特性的接種量（X1）、低聚半乳糖濃度（X2）、發(fā)酵時間（X3）和發(fā)酵溫度（X4）為考量因素，獲得Box-Behnken 試驗結(jié)果與分析（表2），再運用Design Expert V8.0.6 對表2 中的數(shù)據(jù)進行二次多元線性回歸擬合，得到活菌數(shù)Y=8.74+0.057X1+0.062X2+0.14X3?0.27X4?0.063X1X2?0.040X1X3?0.0025X1X4?0.045X2X3?0.0075X2X4?0.005X3X4+0.010X12+0.015X22?0.22X32?0.28X42的回歸方程，接著對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

結(jié)果顯示，模型組P值小于0.01（P=0.0038），說明試驗回歸方程模型顯著。失擬項P值為0.2764，不顯著，證明模型選擇正確；決定系數(shù)R2=0.8201，校正決定系數(shù)R2Adj=0.6402，證明該預(yù)測模型結(jié)果與實驗結(jié)果的擬合性較好。綜上，說明此模型可預(yù)測最佳發(fā)酵條件。

2.4.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面中圖形的陡峭程度反映了兩兩因素之間交互作用對響應(yīng)值變化情況的影響。當響應(yīng)曲面越陡峭，說明交互作用越明顯；當?shù)雀呔€越趨于橢圓，表明因素之間的交互作用越是顯著，呈圓形則說明交互作用不顯著。由圖7 可知，除了接種量和糖添加質(zhì)量濃度這兩因素之間的交互作用外，其余各圖都呈現(xiàn)凸形曲面，即X1（接種量）和X3（發(fā)酵時間）、X1（接種量）和X4（發(fā)酵溫度）、X2（糖添加質(zhì)量濃度）和X3（發(fā)酵時間）、X2（糖添加質(zhì)量濃度）和X4（發(fā)酵溫度）、X3（發(fā)酵時間）和X4（發(fā)酵溫度）之間有一定的相互作用。此外，可以從圖中看出，各因素對活菌數(shù)的影響依次為X4>X3>X2>X1。

圖7 不同因素對發(fā)酵乳活菌數(shù)的交互影響Fig.7 The interactive influence of different factors on viable bacteria counts of fermented milk

根據(jù)軟件Design Expert V8.0.6 預(yù)測以菌液接種量為2.0%、糖添加質(zhì)量濃度為1.0%、發(fā)酵時間為24 h、發(fā)酵溫度為42 ℃是最佳發(fā)酵條件，對應(yīng)理論活菌數(shù)最大值為1.42×108CFU/mL。進一步對最優(yōu)條件進行試驗驗證，三次重復(fù)的活菌數(shù)分別為1.24×108、1.06×108和1.04×108CFU/mL，與通過響應(yīng)面試驗預(yù)測的理論值很接近，說明本模型在模擬發(fā)酵條件上具有可靠性。該發(fā)酵條件是否同樣有利于改善乳品口感、風(fēng)味、營養(yǎng)價值及腸道健康有待進一步探究。

2.5 低聚半乳糖發(fā)酵乳對蠟樣芽孢桿菌的抑制作用

前面研究結(jié)果表明低聚半乳糖改良的培養(yǎng)基能改善植物乳桿菌ZDY2013 發(fā)酵上清抑制蠟樣芽孢桿菌的能力，且前期研究發(fā)現(xiàn)該菌在牛奶發(fā)酵過程中可有效抑制蠟樣芽孢桿菌的繁殖[10]。本研究進一步以乳品中常見污染微生物蠟樣芽孢桿菌作為指示菌，考察乳品中添加低聚半乳糖后進行植物乳桿菌發(fā)酵是否能有效抑制較低濃度蠟樣芽孢桿菌的生長。結(jié)果如圖8 所示，蠟樣芽孢桿菌的總活菌數(shù)在牛奶發(fā)酵24 h 后達到5×105CFU/mL，并在隨后的發(fā)酵過程中維持該數(shù)量級，而該數(shù)量級的蠟樣芽孢桿菌被認為是不會引起食源性疾病的[29]。另外，105CFU/mL低于前期研究發(fā)酵乳中無添加低聚半乳糖時蠟樣芽孢桿菌的最高濃度（1.8×106CFU/mL）[10]，說明添加低聚半乳糖有利于提高植物乳桿菌發(fā)酵乳拮抗蠟樣芽孢桿菌的活性。綜上所述，低聚半乳糖的添加提高了植物乳桿菌發(fā)酵乳預(yù)防蠟樣芽孢桿菌污染的潛力，攝入該發(fā)酵乳可能對腸道健康具有一定的促進作用。

圖8 低聚半乳糖發(fā)酵乳對蠟樣芽孢桿菌的抑制作用Fig.8 Inhibition of GOS fermented milk on B.cereus

3 結(jié)論

植物乳桿菌ZDY2013 能抑制病原微生物并維護宿主腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，同時具有代謝多種碳水化合物并應(yīng)用于發(fā)酵乳的良好潛力。本研究選取具有益生元特性的低聚半乳糖作為植物乳桿菌發(fā)酵乳添加成分，經(jīng)體外代謝評價和單因素實驗確定了植物乳桿菌的接種量、碳源的添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳的活菌數(shù)、pH 和持水力有一定影響；綜合各因素的交互作用，獲得發(fā)酵乳制備的最佳條件：菌液接種量為2%、糖添加質(zhì)量濃度為1.0%、發(fā)酵時間為24 h、發(fā)酵溫度為42 ℃，并經(jīng)實驗得到驗證。另外，添加了低聚半乳糖的發(fā)酵乳對產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的抑制能力較強。本研究將為開發(fā)一種具有益生菌、益生元特性，并抑制病原微生物的功能發(fā)酵乳奠定基礎(chǔ)。