不同加工方式對(duì)羊肚菌水提液鮮味及抗氧化性能的影響

盧 琪，薛淑靜，楊 德，王少華，李 露

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064）

羊肚菌又稱羊蘑、羊肚菜、羊肚蘑等，屬子囊菌門(mén)羊肚菌科[1]，是一種名貴的珍稀食用菌。羊肚菌因味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多肽、多糖、酚類、維生素和微量元素等，同時(shí)兼具營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值而廣受人們的歡迎[2?4]。相關(guān)研究證明，羊肚菌具有多種功能活性，如抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、降血脂、降固醇、保肝健胃等[5?7]。此外，羊肚菌因富含氨基酸和呈味核苷酸，味道鮮美，具有風(fēng)味產(chǎn)品加工潛力。

近年，我國(guó)羊肚菌菌種馴化已取得有效進(jìn)展，種植技術(shù)日益成熟，使得國(guó)內(nèi)羊肚菌種植面積日益增加，產(chǎn)量逐年大幅提升[8?9]。目前，國(guó)內(nèi)羊肚菌主要以鮮品、凍品和干品形式在市場(chǎng)上流通，相關(guān)精深加工產(chǎn)品主要以羊肚菌輔與禽肉，制作成菌肉湯料包的形式[10?11]。羊肚菌菌湯清淡、細(xì)膩、鮮味十足，深受大眾喜愛(ài)，而羊肚菌菌湯的加工方式和風(fēng)味成分尚無(wú)詳細(xì)研究。如何通過(guò)加工手段獲取優(yōu)質(zhì)的羊肚菌菌湯是本文研究的關(guān)鍵。

加工手段對(duì)羊肚菌營(yíng)養(yǎng)成分和呈味物質(zhì)釋放的影響是羊肚菌菌湯提質(zhì)升級(jí)的關(guān)鍵。熱處理是食用菌菌湯加工的常用手段。隨著加工手段的變革，非熱加工如超高壓、均質(zhì)及超聲處理也常用于食品加工。目前，熱加工對(duì)羊肚菌菌湯成分影響的研究，僅限于溫度、料液比等因素的探討[9]，然而非熱加工對(duì)羊肚菌品質(zhì)的影響尚有欠缺。

本文擬采用熱加工（70、90 ℃）和非熱加工（室溫、超聲、均質(zhì)和超高壓），處理不同粒徑的羊肚菌，制備水提液。對(duì)比各水提液的鮮味及抗氧化性能，篩選出最優(yōu)處理工藝，以期為羊肚菌的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌（Morchella esculenta） 于2019 年12月采收于湖北武漢；呈味核苷酸（5’-CMP、5’-UMP、5’-XMP、5’-GMP、5’-IMP 和5’-AMP）、抗壞血酸、2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）、1,3,5-三（2-吡啶基）-2.4.6-三嗪（TPTZ） 源葉生物科技有限公司；游離氨基酸 Sigma-Aldrich 公司；ABTS 試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲醇 Fisher 公司。

Multiskan GO 酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher 公司；LC-20AT HPLC 系統(tǒng) 日本Shimadzu 公司；L-8900 氨基酸分析儀 日本Hitachi 公司；XHF-DY高速均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；KQ5200DE 超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；HPP-650 超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；YR-6L 超微粉碎機(jī) 濟(jì)南銀潤(rùn)包裝機(jī)械有限公司；winner 3003 激光粒度分析儀濟(jì)南微納科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同粒徑羊肚菌菌粉制備 新鮮羊肚菌經(jīng)50 ℃熱風(fēng)干燥后，粉碎，過(guò)80 目篩，再進(jìn)行超微粉碎0、10 和30 min。三種處理對(duì)應(yīng)的羊肚菌粉末粒徑D90分別為（180.79±2.05）、（35.52±1.08）和（6.28±0.17）μm，用P1、P2 和P3 代表上述粒徑的樣品。

1.2.2 羊肚菌水提液制備 采用熱加工和非熱加工制備羊肚菌水提液。菌粉（1.0 g）經(jīng)蒸餾水（30 mL）浸泡0.5 h 后，進(jìn)行下述處理：a.熱處理，上述混合物置于磁力攪拌器，70 和90 ℃條件下700 r/min 攪拌1 h。處理結(jié)束后樣品立即用冷水冷卻，抽濾；b.超聲處理（UT），上述混合物置于超聲清洗儀，40 kHz 下于室溫下提取1 h，冷卻，抽濾；c.均質(zhì)（HG），上述混合物置于均質(zhì)機(jī)，18000 r/min 條件下室溫處理3 min，間歇處理2 次，合并冷卻后抽濾；d.超高壓處理（HHP），上述混合物置于超高壓裝置內(nèi)，500 MPa 室溫保持10 min；冷卻后抽濾；e.室溫（RT），上述混合物置于磁力攪拌器，700 r/min 攪拌1 h，抽濾，以該處理為對(duì)照。

1.2.3 5’-核苷酸分析 采用HPLC 檢測(cè)羊肚菌水提液中5’-核苷酸[12?13]。將上述上清液過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，進(jìn)樣分析。流動(dòng)相為A：20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH5.9）和B：100%甲醇，比例為97:3（A:B，v:v）。流速 0.5 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，運(yùn)行30 min，在254 nm 處進(jìn)行紫外檢測(cè)。通過(guò)各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，結(jié)果折算為每100 克菌粉中5’-核苷酸毫克數(shù)（mg/100 g DW）。

1.2.4 游離氨基酸（FAA）分析 采用氨基酸分析儀檢測(cè)羊肚菌水提液中FAA 含量[14]。將5.0 mL 上清液與相同體積的10%三氯乙酸混合，并在室溫下放置2 h，10000 r/min 離心5min，收集上清，調(diào)整pH 至2.2，過(guò)0.22 μm 濾膜，注入氨基酸分析儀進(jìn)行分析。結(jié)果折算為每100 克菌粉中FAA 毫克數(shù)（mg/100 g DW）。

1.2.5 等鮮度EUC 計(jì)算 由鮮味氨基酸（Glu 或Asp）與5’-核苷酸之間的相互作用計(jì)算等鮮度EUC，根據(jù)以下方法計(jì)算，表示為每100 g 樣品中谷氨酸鈉的含量（g）[15?16]：

其中，ai是鮮味氨基酸（Glu 或Asp）的濃度（g/100 g）；aj是鮮味5’-核苷酸（5’-GMP、5’-AMP、5’-IMP 或5’-XMP）的濃度（g/100 g）；bi是鮮味氨基酸的鮮味相對(duì)濃度（Asp，0.077 和Glu，1）；bj是5'-核苷酸的相對(duì)鮮味濃度（5’-IMP，1；5’-GMP，2.3；5’-AMP，0.18；5’-XMP，0.61）；1218 是協(xié)同作用常數(shù)。

1.2.6 抗氧化能力分析 參考前人的研究，分別采用DPPH、FRAP 和ABTS 法，綜合評(píng)價(jià)羊肚菌水提液的抗氧化能力[17?19]。DPPH 自由基清除能力和FRAP 鐵離子還原能力均以每毫升水提液中抗壞血酸當(dāng)量表示（μmol AAE/mL），ABTS 自由基清除能力以每毫升水提液中Trolox 當(dāng)量表示（μmol TE/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)三次取平均值。采用Duncan 分析進(jìn)行樣本差異性分析（IBM SPSS Statistics 20.0），P<0.05 為顯著性差異。采用HemI（Heatmap Illustrator,version 1.0）用于熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理?xiàng)l件下羊肚菌水提液5’-核苷酸含量

通過(guò)HPLC 分析，羊肚菌水提液中主要包含5’-CMP、5’-UMP、5’-XMP、5’-GMP、5’-IMP 和5’-AMP 等6 種5’-核苷酸，這幾種成分標(biāo)品的色譜圖如圖1 所示，水提液中各5’-核苷酸含量詳見(jiàn)表1。70 ℃-P1、P2 的水提液中5’-核苷酸總含量（1432.34、1473.88mg/100 g DM）要顯著（P<0.05）高于其它處理（682.53 mg/100 g DM～1221.00 mg/100 g DM）。5’-GMP 是食用菌呈鮮味物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)成分[20]，該成分在90 ℃熱處理?xiàng)l件下的含量（128.31 mg/100 g DM～194.36 mg/100 g DM）顯著（P<0.05）高于其它處理（7.50 mg/100 g DM～79.14 mg/100 g DM），推測(cè)高溫處理有利于5’-GMP 溶出至水提液。

表1 不同加工方式對(duì)羊肚菌水提液中5’-核苷酸含量的影響 （mg/100 g DM）Table 1 Effects of different processing methods on 5’-nucleotide content in Morchella esculenta water extract (mg/100 g DM)

圖1 5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 5’-nucleotide standards

70、90 ℃和HG 處理?xiàng)l件下，5’-核苷酸總含量隨著粒徑的減小呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，而UT 和HHP 處理中5’-核苷酸總含量隨著粒徑的減小而增加。推測(cè)過(guò)度粉碎的菌粉（P3）在70、90 ℃和HG處理下，可能導(dǎo)致5’-核苷酸的破壞，而相對(duì)溫和的非熱處理UT 和HHP，會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)菌粉（P3）中5’-核苷酸的溶出。與未超微粉碎相比（P1），超微粉碎（P2 或P3）不同程度地提升羊肚菌水提液5’-核苷酸含量。5’-IMP 是除了5’-GMP 外的鮮味貢獻(xiàn)成分，5’-IMP 經(jīng)過(guò)脫氨基作用生成5’-AMP，具有抑制苦味突出甜味的作用[21]。本研究中70 ℃-P2 中5’-IMP含量最高（541.54 mg/100 g DM），而HG-P2 中5’-AMP含量最高（469.36 mg/100 g DM），可能是由于HGP2 條件下5’-IMP 能更有效地轉(zhuǎn)化為5’-AMP。5’-CMP 和5’-UMP 對(duì)食用菌鮮味成分無(wú)貢獻(xiàn)，二者均在UT-P3 中含量豐富。5’-XMP 對(duì)食用菌鮮味的貢獻(xiàn)介于5’-IMP 和5’-AMP 之間，該成分占5’-核苷酸中含量較低，RT 和UT 處理中僅在超微粉P3 中微量檢測(cè)到，而70 ℃-P3 中5’-XMP 的含量最高，也僅占5’-核苷酸的5.50%，該結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致[22]。

2.2 各處理?xiàng)l件下羊肚菌水提液離氨基酸（FAA）含量

游離氨基酸能為食用菌水提液提供鮮味成分和愉悅的口感。不同加工方式得到羊肚菌水提液中游離氨基酸含量如表2 所示。超高壓（HHP）是一種非熱處理技術(shù)，能保持食品的感官特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，該技術(shù)能通過(guò)破壞細(xì)胞壁、提高細(xì)胞膜通透性來(lái)提高有效成分的溶出[23]。三種粒徑下，超高壓技術(shù)處理得到的羊肚菌水提液中總游離氨基酸的含量（4264.19 mg/100 g DM～5882.81 mg/100 g DM）要顯著高于其它處理（P<0.05），其中鮮味氨基酸（1513.28 mg/100 g DM～2191.22 mg/100 g DM）和甜味氨基酸含量（1075.68 mg/100 g DM～1684.18 mg/100 g DM）尤為豐富。本研究的水提液中尚未檢測(cè)到脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）和蛋氨酸（Met），而張楠等[9]在羊肚菌的菌柄中檢測(cè)到上述成分。范婷婷等[24]在人工栽培的羊肚菌中未發(fā)現(xiàn)脯氨酸（Pro）和色氨酸（Trp），但在野生羊肚菌中各類氨基酸均能檢測(cè)到。推測(cè)產(chǎn)生上述差異的原因可能與羊肚菌的檢測(cè)部位、提取方式、種植手段和種植環(huán)境有關(guān)。

表2 不同加工方式對(duì)羊肚菌水提液中游離氨基酸含量的影響 （mg/100 g DM）Table 2 Effects of different processing methods on FAA content in Morchella esculenta water extract (mg/100 g DM)

各處理?xiàng)l件下，超微粉碎均降低了游離氨基酸的總含量，尤其70 ℃、UT、HG 和HHP 處理中游離氨基酸的總含量隨著粒徑的減小而呈降低的趨勢(shì)，其中HHP-P1 中游離氨基酸總含量最高。P1 條件下各處理的總游離氨基酸含量最高，排序?yàn)椋篐HP>90 ℃>70 ℃>HG>UT>RT。水提液加熱過(guò)程中發(fā)生Strecker降解和Maillard 反應(yīng)，降低水提液中FAA 含量，但同時(shí)也能通過(guò)加熱促進(jìn)蛋白質(zhì)水解，也可能增加水提液中FAA 含量[25]。本研究中除了HHP 外，各粒徑條件下，熱處理水提液中FAA 的含量要高于其它處理，推測(cè)是加熱過(guò)程中其蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸含量高于其氨基酸降解量，其中熱處理水提液中鮮味氨基酸Asp，甜味氨基酸Ser、Thr，苦味氨基酸Leu、Ile，無(wú)味氨基酸Lys、Try 含量豐富。前人對(duì)新鮮的羊肚菌進(jìn)行熱處理制作菌湯研究，其中必需氨基酸中Thr 和Lys 含量豐富，與本研究結(jié)果一致[10]，而其他非熱處理獲取羊肚菌水提液成分的相關(guān)研究相對(duì)欠缺。

RT 和HHP 處理中，鮮味氨基酸分別占32.01%～38.11%，33.31%～37.25%，是FAA 中的主要成分，而其它處理中鮮味氨基酸僅占12.26%～27.21%。相對(duì)于非熱處理，熱處理（70、90 ℃）增加了水提液中苦味氨基酸的比例32.27%～57.33%。通過(guò)等鮮度EUC 的計(jì)算，各處理的EUC 值為48.96～493.97 g MSG/100 g，HHP 處理下，各粒徑菌粉的EUC 值（265.83～493.97 g MSG/100 g）要顯著高于（P<0.05）其它處理（48.96～287.25 g MSG/100 g），其中，RT 處理下EUC 值最低（48.96 g MSG/100 g）。除RT 外，超微粉碎雖然提升羊肚菌水提液5’-核苷酸含量，但降低了提取液中呈鮮味氨基酸和總游離氨基酸（FAA）含量，使得菌粉的EUC 值從106.58 g MSG/100 g～493.97 g MSG/100 g 降低至74.70 g MSG/100 g～364.35 g MSG/100 g，推測(cè)超微粉碎可能破壞了羊肚菌的鮮味。由此，P1 條件下羊肚菌EUC 最佳，排序?yàn)椋篐HP>90 ℃>70 ℃>HG>UT>RT，與總FAA 含量排序一致。鮮味氨基酸和5’-核苷酸能夠協(xié)同作用增強(qiáng)樣品鮮味[26]，本研究中Glu 含量豐富且鮮味相對(duì)濃度為1，是水提液中主要的鮮味貢獻(xiàn)成分，熱處理過(guò)程中此類成分大量游離，其含量遠(yuǎn)高于其它處理（除HHP 外）。熱加工提升了水提液EUC 值，但仍顯著小于HHP 處理（P<0.05），HHP 處理豐富了水提液鮮味成分且HHP-P1 的EUC值最高（493.97 g MSG/100 g）。

2.3 羊肚菌水提液成分的熱圖分析

為了更直觀表述18 種處理方法中羊肚菌水提液中的氨基酸和核苷酸分布情況，采用熱圖分析法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。如圖2 所示，熱圖中越接近藍(lán)色表示成分含量越低，越接近紅色表示成分含量越高。由圖可見(jiàn)，各處理中超高壓處理HHP 中各氨基酸含量較為豐富，尤其鮮味氨基酸谷氨酸含量尤其顯著。為了進(jìn)一步比較各加工手段對(duì)成分含量的影響，利用熱圖進(jìn)行聚類分析。除超高壓處理外，其它加工手段可單獨(dú)聚為一簇，說(shuō)明加工特性能直接影響羊肚菌水提液的成分分布。具體而言，超高壓處理HHP 單獨(dú)聚為一類，該處理中各成分含量豐富，鮮味突出。熱加工（70 和90 ℃）聚為一大類，鮮味次之。其它非熱處理（UT-P1 除外），聚為一類，鮮味較差。就處理方法對(duì)羊肚菌水提液鮮味成分影響的排序?yàn)椋撼邏禾幚?熱處理>其它非熱處理。

圖2 羊肚菌水提液中氨基酸和核苷酸含量的熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of free amino acid and nucleotide content in the water extracts of Morchella esculenta

2.4 抗氧化能力分析

本研究通過(guò)DPPH、FRAP 和ABTS 三種手段，綜合評(píng)價(jià)各羊肚菌水提液的抗氧化能力，如表3所示。其中，DPPH 法代表了樣品清除自由基的能力，F(xiàn)RAP 法展現(xiàn)了體系的還原能力，而ABTS 法反映體系的總抗氧化能力[27]。本研究中除了熱處理外，其它非熱加工（RT、UT、HG 和HHP）水提液的DPPH、FRAP 和ABTS 值均隨著菌粉的粒徑減小而呈下降趨勢(shì)，可能是由于超微粉碎過(guò)程中的劇烈處理破壞了菌粉中的天然活性成分，如酚類、甾醇、氨基酸等。熱處理常被證明能破壞食品體系的抗氧化能力[28?29]，本研究熱處理同樣降低了水提液的抗氧化能力，同一粒徑下熱處理水提液的FRAP和ABTS 值均要低于其它處理。HHP 處理下，各粒徑水提液的抗氧化能力均要優(yōu)于其它處理，推測(cè)HHP處理更有利于抗氧化成分在水提液中溶出。HHPP1 具有最高的抗氧化能力，該處理下羊肚菌水提液的DPPH、FRAP 和ABTS 值要顯著（P<0.05）高于其它處理。

表3 不同處理?xiàng)l件下羊肚菌提取液抗氧化能力對(duì)比Table 3 The comparison of antioxidant abilities of Morchella esculenta extracts processed by different methods

3 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，超微粉碎處理組（P2 或P3）不同程度地提升了羊肚菌水提液中5’-核苷酸含量，但超微粉碎對(duì)羊肚菌水提液中FAA 總含量具有破壞性，未超微粉碎條件下（P1）各處理FAA 總含量最高，排序?yàn)?HHP>90 ℃>70 ℃>HG>UT>RT；90 ℃熱處理?xiàng)l件下，羊肚菌水提液中鮮味主要貢獻(xiàn)成分成分5’-GMP 的含量顯著（P<0.05）高于其它處理，而非熱處理HHP 顯著（P<0.05）提升了肚菌水提液中鮮味氨基酸含量，使得該處理?xiàng)l件下各組羊肚菌水提液均有最優(yōu)的EUC 值；熱處理整體降低了羊肚菌水提液抗氧化能力。最終研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HHP-P1 具有最高EUC 值和抗氧化能力，適用于羊肚菌水提液加工。本研究為羊肚菌的精深加工提供參考。