基于代謝組學(xué)辨析廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)機(jī)體的有益影響

韓坤宸，朱雯君，趙海燕，何潛祖，馬金克，于曉涵，張欽任，李全陽(yáng),

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西大學(xué)醫(yī)院，廣西南寧 530004）

作為系統(tǒng)生物學(xué)的下游，代謝組學(xué)能夠準(zhǔn)確捕捉機(jī)體狀態(tài)的變化，識(shí)別可能的信號(hào)或生物標(biāo)志物，已成為了解機(jī)體健康機(jī)制的重要手段。Ke 等[1]通過(guò)血清代謝組學(xué)鑒定出了中國(guó)高度近視老年人的血清生物標(biāo)志物，并研究了與高度近視相關(guān)的代謝改變；Floegel 等[2]使用靶向代謝組學(xué)鑒定了與2 型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的血清代謝標(biāo)志物。核磁共振氫譜（Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H NMR）因具有對(duì)樣品的非侵入性、非破壞性且重現(xiàn)性高等特點(diǎn)，在代謝組學(xué)研究中被廣泛使用[3]。Rawat 等[4]通過(guò)1H NMR 血清代謝分析揭示了罹患糖尿病及糖尿病相關(guān)并發(fā)癥患者的生物標(biāo)志物；Zhang 等[3]通過(guò)1H NMR 代謝組學(xué)揭示了無(wú)癥狀性高尿酸血癥（HUA）和痛風(fēng)患者的代謝特征，并確定了從HUA 到痛風(fēng)的潛在病理。報(bào)道顯示更多的研究著重于將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于某些具體病例中代謝標(biāo)志物的判定，而用代謝組學(xué)技術(shù)來(lái)揭示飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體健康狀況的改善及代謝物特征變化的研究相對(duì)較少。

飲食是影響人體健康的重要因素[5]。通過(guò)整體的飲食模式而非單一食物或營(yíng)養(yǎng)素干預(yù)被認(rèn)為是改善機(jī)體健康狀態(tài)更有效的方法[6]，美國(guó)心臟協(xié)會(huì)對(duì)健康飲食的定義也側(cè)重于整體的飲食模式[7]。健康的飲食模式可以有效延長(zhǎng)壽命，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，減緩與年齡相關(guān)的慢性疾病的發(fā)生[8?9]。然而，飲食如何影響健康長(zhǎng)壽是極其復(fù)雜的。過(guò)去的研究側(cè)重于從飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體生理生化指標(biāo)，或者某種針對(duì)性病癥的改善狀況來(lái)判定飲食對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用[10?11]。從代謝組學(xué)的角度來(lái)判斷飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體相關(guān)代謝的生物標(biāo)志物和代謝途徑，從而剖析飲食對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)治療影響的研究并不常見(jiàn)。此外，短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）在調(diào)節(jié)宿主健康狀態(tài)，改善機(jī)體罹患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素中發(fā)揮著重要作用[12]。SCFAs 作為微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，其主要產(chǎn)生在腸道。故本研究使用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）靶向檢測(cè)了糞便中SCFAs的變化，以更好地分析所構(gòu)建飲食模式對(duì)機(jī)體代謝的影響。

基于團(tuán)隊(duì)前期成果，本研究試圖從人體試驗(yàn)的角度，分析所構(gòu)建的廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)機(jī)體代謝物的影響，探究飲食引起的血清代謝組學(xué)與糞便SCFAs 的變化，進(jìn)一步分析二者共同影響的潛在通路和對(duì)機(jī)體健康狀態(tài)的有益作用，評(píng)估廣西長(zhǎng)壽飲食模式作為改善機(jī)體健康狀況、降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的飲食的適宜性，也為進(jìn)一步闡明用飲食促健康的生理生化機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氘代重水（純度≥99.9%）、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、偏磷酸、氯化鈉 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所需新鮮食材 當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

Bruker Avance 500 MHz 核磁共振光譜儀 德國(guó)Bruker 光譜儀器公司；7890B 氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀美國(guó)安捷倫公司；Pico17 低溫冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 廣西長(zhǎng)壽飲食模式食譜的凝煉 通過(guò)團(tuán)隊(duì)前期對(duì)廣西長(zhǎng)壽地區(qū)高壽人群隊(duì)列的飲食及代謝物特征、腸道菌群等方面研究后，得知長(zhǎng)壽地區(qū)老人飲食以粥類、粗雜糧類、深色蔬菜類食物為主，具有高膳食纖維、高VA、低能量、低脂肪、低蛋白、低膽固醇的特征[13]。據(jù)此，本團(tuán)隊(duì)用D-半乳糖致衰小鼠、自然衰老小鼠等對(duì)長(zhǎng)壽老人飲食中的特征營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)行探究，主要強(qiáng)調(diào)了膳食纖維和能量的攝入量，同時(shí)結(jié)合一定的維生素、微量元素等優(yōu)化設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在10%能量限制，且包含較高水平膳食纖維攝入的組別中所構(gòu)建的飲食模式降低炎癥，抵抗衰老的效果最好[14?15]。

本研究所設(shè)計(jì)的廣西長(zhǎng)壽飲食模式主要基于團(tuán)隊(duì)前期調(diào)研所得的百歲老人飲食特征以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)居民膳食指南2016 版》和《中國(guó)老年人膳食指南2010》中各營(yíng)養(yǎng)素推薦量，在能量、脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物和膳食纖維上對(duì)廣西長(zhǎng)壽飲食模式進(jìn)行了設(shè)計(jì)和優(yōu)化。其中，能量攝入以膳食指南推薦量為基礎(chǔ)，結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果（10%能量限制）計(jì)算得出[14]。膳食纖維攝入量根據(jù)小鼠實(shí)驗(yàn)中的最佳劑量，結(jié)合對(duì)百歲老人的飲食調(diào)查結(jié)果計(jì)算得出[13?15]。脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物的攝入量均基于百歲老人飲食特點(diǎn)[13]，結(jié)合膳食指南推薦量?jī)?yōu)化設(shè)計(jì)而得，符合膳食指南推薦范圍。以年齡60～70 歲，BMI=21.25（18.5～24.0 的中位數(shù)）的輕體力活動(dòng)男性志愿者為例，設(shè)計(jì)其平均每日所需營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量如下：能量（1710±38）kcal/day、蛋白質(zhì)15%、脂肪25%、碳水化合物60%、膳食纖維攝入量為（32.91±0.73）g/day。該模式實(shí)施過(guò)程中，首先根據(jù)對(duì)志愿者進(jìn)行調(diào)查和測(cè)量得到的性別、體重、每日勞動(dòng)強(qiáng)度等信息，對(duì)志愿者的營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量進(jìn)行針對(duì)性的設(shè)計(jì)。菜單是根據(jù)所設(shè)計(jì)的營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量，結(jié)合廣西長(zhǎng)壽地區(qū)高壽人群隊(duì)列飲食的偏好及廣西長(zhǎng)壽地區(qū)的特色食物設(shè)定的。飲食中包括當(dāng)?shù)胤N植的季節(jié)性水果、蔬菜和谷物，而肉類攝入較少。志愿者的飲食在符合要求的特定地點(diǎn)準(zhǔn)備和供應(yīng)，所有食物都經(jīng)過(guò)精確計(jì)量。

1.2.2 研究設(shè)計(jì) 本研究是一項(xiàng)為期4 周的單臂研究，參與者作為自己的對(duì)照。于2020 年10 月8 日至2020 年12 月1 日通過(guò)傳單、電子郵件和個(gè)人交流等方式招募志愿者。志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡50～75 歲；身體狀態(tài)穩(wěn)定；未長(zhǎng)期服用且實(shí)驗(yàn)前一個(gè)月未服用影響免疫系統(tǒng)的藥物及抗生素；試驗(yàn)前兩周未補(bǔ)充益生元、益生菌或維生素；對(duì)本研究涉及的試驗(yàn)不出現(xiàn)過(guò)敏現(xiàn)象。在篩選過(guò)程中，參與者被告知試驗(yàn)中涉及的內(nèi)容和潛在風(fēng)險(xiǎn)，并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。研究方案已獲得廣西大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.GXU-2020-136）。

為排除其他因素的影響，在試驗(yàn)過(guò)程中，志愿者被要求先進(jìn)行兩周穩(wěn)定的習(xí)慣性飲食，然后接受為期2 周的高依從性廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)，并在基線（Day 1:習(xí)慣性飲食開(kāi)始前）、第2 周結(jié)束（Day 15:習(xí)慣性飲食結(jié)束/廣西長(zhǎng)壽飲食開(kāi)始）和第4 周結(jié)束（Day 29:飲食干預(yù)結(jié)束后）采集志愿者的糞便樣品和禁食一夜后的血液樣品（圖1）。在習(xí)慣性飲食階段，志愿者可自由進(jìn)食，但被要求保持穩(wěn)定的飲食；在廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)期間，志愿者需食用課題組提供的食物，包括早餐、中餐、晚餐、水果和堅(jiān)果。且要求其除自由飲水外，不再食用其他食物。此外，所有志愿者都被要求在參與試驗(yàn)期間保持穩(wěn)定的身體活動(dòng)量。

圖1 樣品采集時(shí)間序列圖示Fig.1 Illustration of sample collection time series

1.2.3 血清樣本的制備 用靜脈穿刺抽取法采集志愿者的空腹血液樣品，在室溫（25 ℃）下靜置30 min，然后在4 ℃、3000 r/min 下離心15 min 以分離血清，并將分離好的血清樣品儲(chǔ)存在?80 °C 冰柜。在核磁共振試驗(yàn)前，將血清樣本在室溫（25 ℃）下解凍后，準(zhǔn)確吸取200 μL 血清樣品至2 mL 無(wú)菌離心管中，加入400 μL 含重水的磷酸鹽緩沖溶液（100%D2O，0.9% NaCl，50 mmol/L 磷酸鹽，pH7.4），混勻后于4 ℃、12000 ×g 下離心10 min，取550 μL 上清液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR 管中進(jìn)行1H NMR 光譜分析。

1.2.4 血清1H NMR 的測(cè)定及代謝標(biāo)志物分析 所有血清樣品在298 K 下用核磁共振光譜儀進(jìn)行分析，工作的1H 共振頻率為500.13 MHz。使用標(biāo)準(zhǔn)Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列[RD-90o-（t-180o-t）n-ACQ]采集一維光譜，同時(shí)采用預(yù)飽和法抑制水峰。采集參數(shù)為：掃描次數(shù)NS=64，采樣點(diǎn)數(shù)TD=65536，譜寬SWH=10000 Hz，馳豫延遲RD=2 s。使 用MestReNova 14.0軟件（Mestrelab Research,Spain）對(duì)1H 核磁共振波譜進(jìn)行相位和基線校正。以α-葡萄糖左鋒的化學(xué)位移5.233 ppm 定標(biāo)，同時(shí)對(duì)化學(xué)位移區(qū)間δ0.00～9.00 ppm 的區(qū)域以δ0.004 ppm 進(jìn)行分段積分，排除水共振區(qū)δ4.70～5.10 ppm 以消除水信號(hào)的影響，最后將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化處理。

使用SIMCA-P 13.0 （Umetrics,Sweden） 軟件進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析。用無(wú)監(jiān)督的主成分分析（principal components analysis，PCA）評(píng)價(jià)志愿者血清代謝物的內(nèi)在聚類。為了最大限度地實(shí)現(xiàn)兩組之間代謝物的分離，使用了正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。使用置換檢驗(yàn)（permutation tests,重復(fù)次數(shù)n=200 次）來(lái)驗(yàn)證模型的有效性。根據(jù)變量投影重要度（variable importance for projection，VIP）>1 初步篩選出差異代謝物，再進(jìn)一步采用配對(duì)t檢驗(yàn)或者配對(duì)Wilcoxon 非參數(shù)檢驗(yàn)，選擇VIP>1 且P<0.05 的代謝物作為具有顯著性差異的代謝標(biāo)志物。

1.2.5 糞便樣品的制備及其短鏈脂肪酸的測(cè)定 在測(cè)定SCFAs 之前，參照祁波等[16]的方法，稍作修改。將乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯配制為梯度混合溶液，進(jìn)行GC-MS 分析，計(jì)算并繪制各SCFAs 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。志愿者需根據(jù)培訓(xùn)要求規(guī)范收集新鮮的糞便樣本。糞便立即放進(jìn)冰盒并盡快轉(zhuǎn)存在?80 ℃冰柜等待分析。取0.2 g糞便樣品加入2 mL 超純水中，渦旋2 min，然后以10000×g 離心15 min。取1 mL 上清液加入250 μL的25%偏磷酸溶液酸化，混勻后加入2 mL 乙酸乙酯萃取，于4 ℃，12000×g 離心5 min，取上層有機(jī)相用0.22 μm 微孔膜過(guò)濾并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，用于GCMS 分析。

GC-MS 分析采用DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱，柱溫：初溫110 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至160 ℃，再以4 ℃/min 升至240 ℃，保持1 min，進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣流速：3 mL/min；分流比：18:1；離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：250 ℃。質(zhì)譜：EI 源轟擊電壓：70 eV，單離子掃描模式：定量離子60、73。

1.2.6 代謝途徑分析 在MetaboAnalyst 5.0 平臺(tái)上，利用代謝組學(xué)途徑分析（MetPA）軟件結(jié)合京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG；http://www.genome.jp/kegg/）構(gòu)建和富集分析代謝途徑，以可視化代謝物網(wǎng)絡(luò)，并確認(rèn)飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體代謝物影響所涉及的靶向代謝通路。

1.3 樣本量計(jì)算

因未曾有用本飲食模式做過(guò)類似的人體研究，故本研究參考Brons 等[17]的方式，使用R 語(yǔ)言進(jìn)行“事后功率”計(jì)算。已有研究證明血液乳酸水平可作為代謝健康狀態(tài)的重要標(biāo)志物，故選取乳酸作為主要的預(yù)后指標(biāo)[18]。根據(jù)本研究的結(jié)果，設(shè)置顯著性水平為0.05，平均差差值為1.53，標(biāo)準(zhǔn)偏差差值為1.07，本研究計(jì)算出12 名受試者即可滿足90%的統(tǒng)計(jì)功效。因此，本研究中14 名志愿者能夠滿足試驗(yàn)需要。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表示為±s。對(duì)于志愿者代謝物的差異變化，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對(duì)的Wilcoxon 非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05。使用Heatmapper 進(jìn)行代謝標(biāo)志物聚類分析，志愿者代謝標(biāo)志物特征曲線分析（receiver operating characteristic curve，ROC）使用R 語(yǔ)言進(jìn)行，以評(píng)估所篩選代謝物的性能和準(zhǔn)確性。使用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試者基礎(chǔ)特征

經(jīng)過(guò)初步篩查，14 名受試者符合納入標(biāo)準(zhǔn)且完成了實(shí)驗(yàn)。受試者基礎(chǔ)特征指標(biāo)如表1 所示。

表1 基線時(shí)志愿者臨床和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征Table 1 Clinical and demographic characteristics of volunteers at baseline

2.2 廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)志愿者血清代謝物的影響

圖2 顯示了志愿者習(xí)慣性飲食階段和廣西長(zhǎng)壽飲食階段血清樣本代表性的500 MHz1H-NMR 光譜圖。根據(jù)每種代謝物的化學(xué)位移和信號(hào)多樣性，結(jié)合先前文獻(xiàn)[4,19?20]和人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB；http://www.hmdb.ca/）鑒定并量化了33 種不同的代謝物。

圖2 志愿者習(xí)慣性飲食階段和廣西長(zhǎng)壽飲食階段的代表性CPMG 1H NMR 血清光譜Fig.2 Typical 500 MHz 1H NMR spectra of serum extracts for the volunteer with habitual diet and Guangxi longevity dietary

為了辨析廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)血清代謝物的影響，對(duì)結(jié)果進(jìn)行了PCA 分析。圖3A 顯示了志愿者習(xí)慣性飲食前和廣西長(zhǎng)壽飲食前的PC1 與PC2 得分圖，經(jīng)過(guò)PCA 分析得到了4 個(gè)主成分，R2X=0.596，血清代謝物的分布并未表現(xiàn)出顯著差異。為了凸顯志愿者習(xí)慣性飲食前和廣西長(zhǎng)壽飲食前血清代謝物的組間差異，使用OPLS-DA 來(lái)可視化代謝物差異。經(jīng)過(guò)OPLS-DA 分析，R2Y=0.17，Q2=0.069，同時(shí)，模型CV-ANOVA 測(cè)試得分為P=0.409，因Q2<0.4且P>0.05，故OPLS-DA 模型無(wú)效，表明志愿者的習(xí)慣性飲食前期和廣西長(zhǎng)壽飲食前期的血清代謝物之間無(wú)顯著差異。圖3B 顯示了志愿者習(xí)慣性飲食后和廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)后的PC1 與PC2 得分圖，經(jīng)過(guò)PCA 分析得到了5 個(gè)主成分，R2X=0.662，進(jìn)一步使用OPLS-DA 分析來(lái)可視化代謝物差異（圖3C）。所得參數(shù)為：R2Y=0.792，Q2=0.603，模型CV-ANOVA測(cè)試得分為P=0.002，因Q2>0.4 且P<0.05，故表明該模型可靠，即該模型對(duì)志愿者的血清代謝物分離有很好的效果。對(duì)此進(jìn)行置換檢驗(yàn)（200 次），以進(jìn)一步評(píng)估模型的穩(wěn)健性，因置換檢驗(yàn)中的R2和Q2值均低于相應(yīng)的原始值，Q2的回歸線具有負(fù)截距（圖3D），該結(jié)果表明構(gòu)建的模型具有良好的擬合性和高可預(yù)測(cè)性，并可用于進(jìn)一步篩選習(xí)慣性飲食后和廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)后志愿者血清的差異性代謝物。

圖3 血清1H NMR 數(shù)據(jù)的多元分析Fig.3 Multivariate data analysis of serum 1H NMR data

2.3 血清差異代謝物的篩選

根據(jù)OPLS-DA 評(píng)分圖中的VIP 值（VIP>1），結(jié)合P<0.05，篩選出明顯不同的代謝物譜，并將其選為潛在的代謝標(biāo)志物，以確定與習(xí)慣性飲食相比，廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)于血清代謝物的本質(zhì)影響。共有6 種代謝物發(fā)生了顯著變化，其中，組氨酸、甘油、α-葡萄糖、β-葡萄糖相對(duì)豐度顯著增加，膽堿和乳酸的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 血清中主要代謝物的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 2 Statistical analysis results of the main metabolite in serum

2.4 糞便短鏈脂肪酸的變化

SCFAs 主要通過(guò)腸道微生物發(fā)酵不可消化的碳水化合物產(chǎn)生。已有研究證明SCFAs 的升高對(duì)健康有著諸多裨益，如改善血糖和血脂、降低機(jī)體炎癥等[21]。研究表明，短期的飲食即可迅速改變腸道微生物群的組成和活性，從而影響SCFAs 的產(chǎn)生[22?23]。因此，本研究同步檢測(cè)了糞便SCFAs 的變化，以探究廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)機(jī)體代謝的影響。結(jié)果表明，志愿者在習(xí)慣性飲食階段的糞便SCFAs 無(wú)顯著變化（P?0.05），而在廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)后，乙酸鹽和丁酸鹽有了顯著提高（P<0.05）。比較而言，丙酸鹽、戊酸鹽、異丁酸鹽和異戊酸鹽也有所升高，但是這種趨勢(shì)并不顯著（P?0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 糞便SCFAs 的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis results of the main SCFAs in feces

2.5 關(guān)鍵代謝物的聚類分析和性能評(píng)估

為了更好地可視化廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)所篩選血液代謝標(biāo)志物和有關(guān)糞便SCFAs 的影響，將Euclidean 算法用于距離測(cè)量，結(jié)合Average Linkage 算法進(jìn)行了聚類分析（圖4A）。圖中縱坐標(biāo)代表8 種代謝標(biāo)志物，橫坐標(biāo)代表習(xí)慣性飲食和廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)的志愿者樣本。顏色表示代謝物值，其中紫色最低，紅色最高?？梢钥闯?，與習(xí)慣性飲食相比，在廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)后，8 種代謝標(biāo)志物有著相對(duì)明顯的表達(dá)差異。同時(shí)，采用蒙特卡羅交叉驗(yàn)證（Monte Carlo Cross Validation）和線性支持向量機(jī)（Support Vector Machine）的方法生成ROC 曲線，以進(jìn)一步評(píng)估所篩選的代謝標(biāo)志物差異性（圖4B）。結(jié)果表明，這8 種代謝標(biāo)志物曲線下的面積（area under curve，AUC）分別為：α-葡萄糖=0.7347；β-葡萄糖=0.7245；組氨酸=0.6939；膽堿=0.7500；甘油=0.7194；乳酸=0.6837；乙酸鹽=0.7704；丁酸鹽=0.8469。參考文獻(xiàn)[24?25]的方法，認(rèn)為AUC 值大于0.6 時(shí)，則模型預(yù)測(cè)有效，由圖4B 可知本研究中8 種代謝標(biāo)志物的AUC 值均大于0.6[25?26]，故認(rèn)為上述8 種成分均可用于后續(xù)分析（圖4B）。

圖4 代謝標(biāo)志物的聚類分析及ROC 分析Fig.4 Cluster analysis and ROC analysis of potential biomarkers

2.6 代謝途徑分析

為了解志愿者的代謝物變化是否反映了其代謝途徑的協(xié)同變化，使用MetaboAnalyst 5.0 結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)將血液代謝標(biāo)志物和有顯著變化的糞便SCFAs 分析結(jié)果用于代謝物組富集分析和途徑分析（圖5A 和5B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3 種潛在的代謝途徑可能對(duì)改善機(jī)體健康狀態(tài)有關(guān)鍵作用[24?25,27]。分別為：a.糖酵解/糖異生途徑；b.丙酮酸代謝；c.半乳糖代謝。結(jié)果表明，本飲食模式對(duì)機(jī)體健康狀態(tài)的影響與不同的代謝途徑有關(guān)，且這些代謝途徑可能在改善機(jī)體健康狀態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖5 代謝標(biāo)志物路徑富集分析和拓?fù)浞治鯢ig.5 Metabolic marker pathway enrichment analysis and topology analysis

3 討論

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)小鼠具有良好的抗衰老作用[14?15]。本研究則發(fā)現(xiàn)短期的廣西長(zhǎng)壽飲食模式干預(yù)后，志愿者血清代謝物中甘油、組氨酸、α-葡萄糖和β-葡萄糖相對(duì)豐度顯著增加（P<0.05），膽堿和乳酸的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05），同時(shí)，糞便中的乙酸鹽和丁酸鹽含量也顯著上升（P<0.05）。還發(fā)現(xiàn)代謝物的變化與3 條途徑密切相關(guān)。

甘油作為甘油三酯的骨架成分，是連接糖代謝和脂肪酸代謝的關(guān)鍵。研究表明，甘油在體內(nèi)可被轉(zhuǎn)化為磷酸二羥基丙酮進(jìn)入糖酵解過(guò)程，為機(jī)體提供能量[28]。本研究發(fā)現(xiàn)在兩周高依從性的飲食干預(yù)之后，志愿者血清甘油的含量略有上升，這或許存在如下原因：廣西長(zhǎng)壽飲食模式中富含水果、蔬菜，而肉類含量較少，故總體能量攝入較志愿者習(xí)慣性飲食階段相比較低，從而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪分解增加，引起甘油濃度增加，以參與糖酵解過(guò)程。亦有研究證明，甘油含量的升高對(duì)調(diào)節(jié)高脂血癥有著積極作用[29]。故志愿者甘油水平的升高，可能對(duì)調(diào)節(jié)血脂水平發(fā)揮著一定的作用。

已有研究證明組氨酸作為人體必需氨基酸，其血清含量與機(jī)體健康衰老密切相關(guān)[30]。同時(shí)，血液組氨酸濃度已被證明與機(jī)體炎癥狀態(tài)和氧化應(yīng)激水平相關(guān)。研究表明，組氨酸可通過(guò)與二價(jià)金屬離子螯合，清除羥基自由基和單線態(tài)氧，從而改善機(jī)體的抗氧化水平，組氨酸的抗炎作用則可通過(guò)調(diào)控機(jī)體NFkB 通路實(shí)現(xiàn)[31]。組氨酸在體內(nèi)還可通過(guò)甲氨基谷氨酸在依賴四氫葉酸的途徑中轉(zhuǎn)化為谷氨酸，故研究表明，葉酸攝入不足會(huì)導(dǎo)致組氨酸的排泄增加，從而引起血液中組氨酸濃度降低[32]。Hefni 等[33]通過(guò)對(duì)健康志愿者進(jìn)行富含葉酸的飲食干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)其血液中組氨酸豐度升高。廣西長(zhǎng)壽飲食模式中包含高水平的深色蔬菜類、水果類食物，且注重對(duì)豆類食物的攝入，故飲食中葉酸含量相對(duì)較高，飲食干預(yù)后組氨酸的豐度增高可能與此相關(guān)。此外，高水平的組氨酸還被證明可以有效改善胰島素敏感性，對(duì)機(jī)體代謝紊亂起到良好的調(diào)節(jié)作用[34]。因此，本次研究結(jié)束后，志愿者血清代謝物中組氨酸水平的顯著升高，可能對(duì)改善機(jī)體炎癥和健康狀態(tài)，提高機(jī)體抗氧化水平具有重要作用。

志愿者血清中的乳酸水平在本次飲食干預(yù)后有了顯著下降（P<0.05），這可能也是志愿者健康狀態(tài)改善的標(biāo)志。研究證明乳酸水平與胰島素敏感性之間存在著顯著的反比關(guān)系[35]。當(dāng)胰島素敏感性受損時(shí)，會(huì)降低機(jī)體內(nèi)以糖原形式儲(chǔ)存葡萄糖的能力，將攝入的碳水化合物更多的轉(zhuǎn)化為乳酸，從而導(dǎo)致血液中乳酸水平升高[36]。故飲食干預(yù)后乳酸水平的降低和葡萄糖水平的升高可能反映了廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，Xu 等[37]的研究表明高脂肪飲食會(huì)使血液乳酸水平升高，亦有研究表明低蛋白飲食可以有效降低乳酸水平[38]。在廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)期間，志愿者攝入脂肪和蛋白質(zhì)相比其習(xí)慣性飲食期間較少，這可能與乳酸水平降低有關(guān)。此外，乳酸水平的變化可能對(duì)丙酮酸代謝途徑有著一定的影響。在體內(nèi)，乳酸可通過(guò)乳酸脫氫酶生成丙酮酸，用于糖異生過(guò)程。且神經(jīng)元代謝所需的能量是由乳酸作為代謝底物轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生的[39]。還有研究表明，機(jī)體衰老會(huì)影響丙酮酸代謝過(guò)程，并通過(guò)降低檸檬酸循環(huán)中的丙酮酸流量造成乳酸水平的增加[40]。結(jié)合這些報(bào)道分析本研究所得結(jié)果，認(rèn)為飲食干預(yù)后志愿者乳酸水平的下降或許對(duì)調(diào)節(jié)胰島素敏感性，維持機(jī)體健康狀態(tài)，延緩衰老具有積極作用。

飲食干預(yù)后，志愿者血清中的膽堿豐度也有了顯著降低。已有研究證明，膽堿與甘油三酯、血糖等心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)顯著正相關(guān)[41]，還有報(bào)道高水平的血清膽堿濃度也被認(rèn)為與結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[42]。Heianza 等[43]的研究表明低熱量飲食干預(yù)會(huì)使志愿者血液中膽堿水平降低，這可能是飲食干預(yù)后志愿者膽堿豐度降低的原因。此外，在機(jī)體內(nèi)，膽堿是生成氧化三甲胺的關(guān)鍵底物，氧化三甲胺被證明是與心血管疾病如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的預(yù)測(cè)因子[44]。Abbasalizad 等[45]的薈萃分析結(jié)果也表明，氧化三甲胺濃度與高血壓風(fēng)險(xiǎn)之間呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)聯(lián)，并與HDL-C 等心血管代謝風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)相關(guān)。故飲食干預(yù)后血清膽堿水平的顯著降低，表明了廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)降低志愿者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、改善機(jī)體健康狀況密切相關(guān)。

乙酸鹽和丁酸鹽作為代表性的SCFAs，在本次飲食干預(yù)后有了顯著升高（P<0.05）。研究表明，乙酸鹽和丁酸鹽因可以有效防止β細(xì)胞凋亡，使胰島細(xì)胞具抗氧化作用，故在控制糖尿病方面具有積極影響[46]。同時(shí)，丁酸鹽可有效改善機(jī)體血壓狀況，通過(guò)下調(diào)膽固醇生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)來(lái)改善機(jī)體血脂水平[47]，且在維持腸道上皮細(xì)胞完整性方面也有積極作用[48]。在飲食干預(yù)后，志愿者糞便中乙酸鹽和丁酸鹽水平顯著升高，潛在原因可能是飲食中高水平的谷物、水果和蔬菜有效增加了可降解纖維的細(xì)菌數(shù)量所致[49]。Quercia 等[50]的研究也表明，富含高纖維的飲食模式可有效增加腸道菌群產(chǎn)生的SCFAs，這與本研究結(jié)果一致。因此，廣西長(zhǎng)壽飲食干預(yù)后志愿者糞便中乙酸鹽和丁酸鹽的顯著升高可能對(duì)改善血糖，血壓和血脂水平，預(yù)防機(jī)體罹患心血管疾病發(fā)揮重要作用。

Jee 等[51]的研究表明了低水平葡萄糖濃度對(duì)機(jī)體健康的有益作用，本次試驗(yàn)的志愿者血清中的葡萄糖水平有所升高，這種現(xiàn)象或許可以這樣理解：當(dāng)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)時(shí)，免疫細(xì)胞會(huì)優(yōu)先使用糖酵解供能，從而加速機(jī)體糖酵解過(guò)程，致使機(jī)體葡萄糖水平降低[52]。適當(dāng)范圍的血清葡萄糖增加可能代表著機(jī)體炎癥狀況的改善。同時(shí)，半乳糖是葡萄糖產(chǎn)生的前體，在體內(nèi)可通過(guò)轉(zhuǎn)化為葡萄糖1-磷酸參與葡萄糖代謝過(guò)程。研究表明，過(guò)量的半乳糖積累會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂[53]。因此，血液葡萄糖水平的升高可能與半乳糖代謝途徑相關(guān)。此外，葡萄糖水平的升高也可能與糖酵解/糖異生途徑相關(guān)。乳酸在體內(nèi)參與糖異生途徑可以產(chǎn)生內(nèi)源性葡萄糖，糖異生途徑可在機(jī)體血糖水平低時(shí)，通過(guò)非糖前體物質(zhì)合成葡萄糖，為大腦等組織提供能量，保證機(jī)體需求，本研究發(fā)現(xiàn)的志愿者機(jī)體乳酸鹽的顯著降低也應(yīng)該能夠?yàn)檫@一判斷提供支持，但要下結(jié)論則仍需要結(jié)合志愿者狀態(tài)進(jìn)行更多的研究。

4 結(jié)論

本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)探究了廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)志愿者代謝物的影響。結(jié)果表明：與習(xí)慣性飲食相比，廣西長(zhǎng)壽飲食模式對(duì)志愿者血清代謝物和糞便SCFAs 有著明顯的改變，經(jīng)過(guò)分析共篩選出8 種具有顯著差異的代謝物，分別為組氨酸、甘油、α-葡萄糖、β-葡萄糖、膽堿、乳酸、乙酸鹽和丁酸鹽（P<0.05）。這些差異代謝物主要涉及糖酵解/糖異生途徑、丙酮酸代謝和半乳糖代謝3 條代謝途徑，其含量變化趨勢(shì)從代謝組學(xué)的角度說(shuō)明了廣西長(zhǎng)壽飲食模式可能在一定程度上對(duì)降低炎癥和罹患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，提高機(jī)體抗氧化能力，延緩衰老進(jìn)程具有積極作用。本研究為通過(guò)飲食干預(yù)改善機(jī)體代謝狀況、維持機(jī)體健康狀態(tài)提供了新的策略，也從代謝組學(xué)的角度對(duì)廣西長(zhǎng)壽飲食模式益生效果的作用機(jī)制進(jìn)行了一定的闡釋。