皮質(zhì)類固醇結合球蛋白的肝外表達研究進展

張雨欣，王暢

（煙臺大學 藥學院，山東煙臺 264005）

皮質(zhì)類固醇結合球蛋白（Corticosteroid-Binding Globulin，CBG），又稱轉皮質(zhì)素（transcortin），1956年，DAUGHADAY通過平衡透析法首次發(fā)現(xiàn)；1961年，SEAL和DOE首次獲得純化CBG；20世界90年代起，在許多物種中對其進行克隆和表征[1]。CBG是一種與類固醇激素密切相關的單體糖蛋白，主要由肝臟合成，分泌入血調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇（CORT）的濃度，在皮質(zhì)醇分泌高峰時起到緩沖作用，當局部出現(xiàn)炎癥時，CBG作為皮質(zhì)醇的儲庫又可快速釋放大量皮質(zhì)醇，發(fā)揮抗炎作用。已有證據(jù)表明，CBG廣泛分布在不同組織中，肝臟不是CBG的唯一合成場所[2]。但其在組織中的功能是否同經(jīng)典血液學功能一致，是否存在特異性的其他相關功能值得深入探究。本文簡述了CBG的特點及其經(jīng)典血液學功能，并總結了CBG在肝外組織中表達及功能的研究進展。

1 CBG簡介

CBG由405個氨基酸殘基組成，一級結構分子量約42 kDa，有6個N-糖基化位點，其中Asn347糖化為其發(fā)揮結合活性所必需[3]，非糖基化CBG結合皮質(zhì)醇的能力比正常CBG低約60%[4]。CBG屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）超家族成員，與該家族中的抗胰蛋白酶（ATT）有40%以上的結構同源性[5]，具有serpin典型的三維結構特征：（1）包括三個β-折疊（A、B、C）、九個α-螺旋（hA～hI）、一個反應中心環(huán)（RCL），其中β-折疊B、α-螺旋hH和α-螺旋hA構成CBG的皮質(zhì)醇結合口袋，RCL為中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）的結合靶標；（2）在生理條件下CBG有R構象（Relaxed Conformation）與S構象（Stressed Conformation）兩種狀態(tài)，當NE插入到裸露RCL的Val344和Thr345之間，破壞皮質(zhì)醇結合位點，S構象不可逆地轉換成R構象，hD解螺旋，則大量皮質(zhì)醇瞬時釋放發(fā)揮局部抗炎作用。其中，S構象CBG與皮質(zhì)醇的結合力高，又稱為高親和力CBG（ha CBG），R構象CBG又稱低親和力CBG（la CBG）[6-8]。

糖皮質(zhì)激素（GCs）并不是CBG的唯一配體，性激素（SH）、鹽皮質(zhì)激素（MCs）等也可與CBG結合，且結合特征具有物種差異性[9]：人CBG與類固醇激素結合能力為皮質(zhì)醇＞皮質(zhì)酮＞17-羥基孕酮＞孕酮＞可的松＞醛固酮，幾乎不結合雄激素[10]；而鳥類沒有性激素結合球蛋白，CBG能以高親和力結合雄激素[9,11]。

2 影響CBG變化的因素

在生理狀態(tài)下，人血CBG的循環(huán)濃度在30～52 pg/mL，呈晝夜節(jié)律變化，18:00濃度最高，03:00左右濃度最低[12]。妊娠期受到雌激素的影響，隨孕齡增加，CBG逐漸增加，妊娠末期可達正常的兩倍。為了確保皮質(zhì)醇運輸至胎兒組織，其在合體滋養(yǎng)細胞膜的親和力較正常狀態(tài)CBG高約60倍，稱作“妊娠特異性CBG”，能以高親和力與孕酮結合，影響外周血和母-胎界面的孕酮水平[13-14]。在病理狀態(tài)下，CBG的變化多伴隨GCs異常。例如，多發(fā)性創(chuàng)傷患者的游離皮質(zhì)醇減少、CBG增加；敗血癥、燒傷、感染性休克、糖尿病患者的游離皮質(zhì)醇增加，CBG水平降低；在膿毒血癥中，血漿中的CBG水平可迅速減少50%，從而增加游離的皮質(zhì)醇水平，進而放大下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的激活效應。因此，一般認為CBG是一種負性調(diào)控的急性期反應物[10]。目前已發(fā)現(xiàn)4種遺傳性CBG突變：CBG Leuven和CBG Lyon患者的皮質(zhì)醇結合力降低70%～75%，CBG 0患者的CBG全缺失，CBG Santiago患者的晨時皮質(zhì)醇及促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）刺激下的峰值皮質(zhì)醇水平均降低。CBG功能缺陷的診斷和生理后果仍不明確，突變患者可能會表現(xiàn)出慢性疼痛、低血壓、疲累、偏頭痛、抑郁等腎上腺功能不全的癥狀，但并不完全相關[5,15]。

白介素-6（IL-6）是早期炎癥反應的重要促炎細胞因子，能夠在轉錄水平抑制CBG的合成[16]，且CBG基因啟動子中存在IL-6的響應元件[17]。在HepG2細胞中觀察到胰島素及胰島素樣因子（IGF-1）能夠抑制CBG的合成與分泌[18]。人體試驗發(fā)現(xiàn)，胰島素對CBG的抑制效應與糖耐受及體脂等個體因素有關：在超重和肥胖成人中，肥胖的耐葡萄糖受試者表現(xiàn)出強烈的血清CBG抑制效應；相反，在體脂率低的成人中胰島素分泌越高，血清CBG濃度越低[19]。口服避孕藥（如炔雌醇）能夠增加CBG的合成，其與雌激素α受體有關[20]；腎上腺皮質(zhì)類藥物米托坦同樣可以增加CBG的合成[21]。甲狀腺激素能夠提高基礎代謝率，研究表明，內(nèi)源和外源性甲狀腺激素降低人血漿CBG水平，甲狀腺激素對CBG生物合成的抑制作用可能有助于維持血漿葡萄糖水平，以滿足由激素升高引起的代謝需求增加；但不同體外研究結果存在差異，可能與試驗方法有關[22]。在生理范圍內(nèi)，皮質(zhì)醇與CBG的結合對溫度變化非常敏感，親和力隨溫度升高而明顯減小，HENLEY和LIGHTMAN發(fā)現(xiàn)，在35～42℃內(nèi)，CBG會在發(fā)燒或外部熱源刺激下釋放皮質(zhì)醇，但對生理范圍內(nèi)的pH變化不敏感[23]。

3 CBG的經(jīng)典功能

經(jīng)典的CBG功能為由肝臟合成并分泌入血，發(fā)揮皮質(zhì)醇儲庫及運輸?shù)淖饔?。血漿中白蛋白與CBG含量比約為775∶1，37 ℃下CBG與皮質(zhì)醇的結合常數(shù)為3×107L/mol，而白蛋白主要結合人工合成的皮質(zhì)激素、MCs等，與皮質(zhì)醇親和力低，結合常數(shù)為0.5×104L/mol[24-27]。生理狀態(tài)下，血漿游離皮質(zhì)醇含量小于血漿皮質(zhì)醇總量的8%，有80%～90%的循環(huán)血皮質(zhì)醇呈蛋白結合態(tài)[28-30]；當局部組織有炎癥發(fā)生時，攜帶皮質(zhì)醇的CBG在炎癥部位聚集，在NE的作用下ha CBG轉換為la CBG[31]，或者由胰凝乳蛋白酶將反應中心環(huán)上的兩個亮氨酸殘基裂解[32]，從而局部釋放大量皮質(zhì)醇，進入細胞發(fā)揮抗炎作用。

CBG經(jīng)典功能如圖1所示，黑色圓圈代表的生理過程分別為：（1）游離皮質(zhì)醇擴散到細胞中，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)生理活動；（2）循環(huán)中，15%的皮質(zhì)醇以低親和力與多含量白蛋白結合；（3）高親和力CBG構成皮質(zhì)醇儲庫，有針對性地將皮質(zhì)醇輸送到炎癥部位；蛋白水解酶（如中性粒細胞分泌的中性粒細胞彈性酶）裂解CBG，降低皮質(zhì)醇結合的親和力并釋放出皮質(zhì)醇；（4）CBG對溫度變化敏感，結合親和力降低，少量釋放皮質(zhì)醇；（5）低親和力CBG仍能部分結合皮質(zhì)醇，作為重要的動態(tài)緩沖器；（6）皮質(zhì)醇結合的CBG可能與特定的受體結合；（7）CBG mRNA在細胞內(nèi)定位，可能調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇進出特定細胞。

圖1 CBG經(jīng)典功能

目前，人們對血CBG的作用闡釋可分為總激素、游離激素和結合激素三種經(jīng)典假說[33]，MALISCH和SATTERLEE[34]提出的儲庫假說可視為對游離激素假說的進一步闡述。（1）總激素假說：該假說認為血漿中的所有激素（結合態(tài)和游離態(tài)）均可自由進入組織，結合相應受體發(fā)揮效應，即100%的血漿類固醇具有生物活性，水溶性的CBG結合脂溶性激素主要發(fā)揮載體功能[35]。（2）游離激素假說：生理條件下，CBG大小通常為50～60 kDa，同CBG結合的激素均無法自由進入組織液，只有游離態(tài)激素能夠發(fā)揮生物活性[10]。儲庫假說認為，不僅游離激素具有生物學活性，類固醇激素-CBG復合物同樣具有其他生物學活性，血漿中與激素結合的CBG可作為儲庫，當CBG的含量或結合親和力下降時，釋放結合激素發(fā)揮生物活性，CBG的節(jié)律變化即為儲庫假說的有力證據(jù)[36]。（3）結合激素假說：該假說同樣認為類固醇激素-CBG復合物有生物學活性，并猜想細胞膜上存在相應的CORT-CBG結合受體，CORT-CBG復合物與受體結合發(fā)揮直接或間接效應。此猜想主要建立在對腦內(nèi)CBG研究的基礎上，但未有實驗性證據(jù)，作者認為若能夠在脈管系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)相關的膜轉運蛋白，且影響細胞外CBG結合激素的功能時，結合激素假說或許將有實質(zhì)性突破[37]。

4 CBG在肝外組織中的分布

4.1 CBG在腦內(nèi)的表達

1984年，在人腦脊液（CSF）中發(fā)現(xiàn)有濃度低于血漿的CBG存在[38-39]，但不能確定其來源；2006年，MOPERT等[40]第一次在大鼠下丘腦中檢測出CBG；隨后，人們發(fā)現(xiàn)CBG在不同腦區(qū)、不同神經(jīng)細胞群（神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞）中廣泛分布，在大鼠和小鼠腦中的伏隔核、丘腦、中隔、海馬、蒼白球、杏仁核、布羅卡斯區(qū)及大腦皮層等區(qū)域均有CBG的表達[41-43]；此外，發(fā)現(xiàn)下丘腦含有編碼CBG的mRNA，且全序列測定結果顯示，CBG的下丘腦cDNA與肝臟完全一致[41]，由于大小限制CBG不能通過血腦屏障。以上這些研究共同說明腦組織能夠自身生成CBG。

中樞CBG廣泛分布很可能具有某些特殊功能，并且與GCs密切相關。下丘腦中的CBG與神經(jīng)腦垂體激素-加壓素和催產(chǎn)素共定位，用秋水仙堿預處理后CBG的免疫反應性增加，說明CBG可隨兩種激素一同沿細胞軸突在軸漿中向末梢流動，釋放到體循環(huán)中，即CBG很可能參與了HPA軸中的某一環(huán)節(jié)[44]。特異性敲除CBG基因的小鼠在應激期間能夠觀察到絕望行為和記憶變化，表現(xiàn)出更多的抑郁樣行為學特征，這種特異性的神經(jīng)變化表明CBG可能不僅局限于參與炎癥反應，在情緒調(diào)控中也有重要作用。熒光分析發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)CBG與糖皮質(zhì)激素受體不處同一位置，可能某些神經(jīng)元中產(chǎn)生的CBG能將糖皮質(zhì)激素輸送到無糖皮質(zhì)激素受體的細胞中，即CBG可能參與了中樞類固醇激素的非基因組作用機制[45]。

4.2 CBG在心臟的表達

RT-PCR表明，人心肌細胞能夠自主合成CBG，且擴增大小同肝臟CBG相同；熒光染色結果顯示，CBG在近乎所有心肌細胞質(zhì)中有免疫反應性，其在浦肯野纖維中的免疫原性最強，在細胞膜、血管內(nèi)皮細胞、心肌動脈壁上的平滑肌細胞及心內(nèi)膜細胞核中也有較強的熒光反應；熒光共定位實驗顯示，CBG與鹽皮質(zhì)激素受體（MR）共定位[46]。

CBG能夠與GCs、MCs結合，因此心肌CBG可能發(fā)揮同血漿CBG類似的緩沖作用，能夠調(diào)控激素釋放，平衡GCs和MCs水平，起到心肌保護作用。心肌細胞中糖皮質(zhì)激素受體（GR）含量低，GCs主要同核MR結合發(fā)揮慢效應[47-48]；CBG與MR共定位，可能作為激素與受體結合前的中間介質(zhì)，起到傳遞類固醇激素的連接作用。浦肯野纖維是一種特化的心肌細胞，能夠快速有效地傳導心臟動作電位，協(xié)調(diào)心臟收縮，且與心律失常、心源性猝死等疾病的發(fā)生密切相關。已有研究證明，長期應激與心律失常的發(fā)生有關，CBG在該處的強免疫原性提示其可能參與了心臟傳導系統(tǒng)功能[49]。類固醇激素及其受體與心血管系統(tǒng)的作用復雜，近年來的研究認為，GCs存在另外的獨立于核受體的快速非基因組效應，但具體機制未明；心肌細胞膜上檢測到有CBG的免疫原性，因此猜測存在CBG的膜受體，可與配體GC-CBG復合物結合，發(fā)揮快速非基因組效應[23,50]。

4.3 CBG在睪丸的表達

1987年，HAMMOND等[37]通過Northern blotting方法發(fā)現(xiàn)睪丸組織中有低水平的CBG表達；SUN等通過RNA熒光原位雜交（FISH）首次證實了CBG在睪丸間質(zhì)細胞中特異性表達；過表達CBG后，與類固醇合成相關的四種蛋白（StAR，CYP11A1，CYP17A1和3β-HSD）上調(diào)；敲低CBG后細胞孕激素水平顯著下降，與類固醇激素合成相關的蛋白質(zhì)水平也相應降低；黃體生成素（LH）通過G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號通路調(diào)控性激素的合成，研究顯示LH能夠刺激細胞產(chǎn)生及分泌CBG，提示CBG在睪丸間質(zhì)細胞中的表達可能與性激素的合成有關；蛋白印跡結果顯示，在小鼠睪丸中觀察到CBG的兩種電泳亞型，表明CBG具有糖基化異質(zhì)性[51]。糖代謝組學研究認為，CBG在不同生理狀態(tài)下N-糖基化的程度不同，不同的糖基化方式可能影響CBG的折疊、分泌、半衰期及對類固醇激素的靶向作用，并影響其生物學功能[52]。這些研究為CBG發(fā)揮細胞組織內(nèi)的激素轉運體作用假說提供了依據(jù)，睪丸間質(zhì)細胞CBG的特異性表達在睪酮合成、分泌等過程中的作用值得進一步探索。

4.4 CBG在白色脂肪組織的表達

白色脂肪組織（WAT）是儲存能量的主要部位，也是GCs的主要靶組織。del MAR GRASA等[53]在WAT質(zhì)膜細胞周圍的薄層中發(fā)現(xiàn)有CBG表達，卵巢周圍的WAT中有CBG的mRNA，證明WAT能夠產(chǎn)生CBG，但合成能力遠小于肝臟。GULFO等[54]發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)過量的情況下，CBG缺乏會促使脂質(zhì)從皮下脂肪分配到內(nèi)臟脂肪庫，并影響Ⅱ型11β-羥基類固醇脫氫酶（一種控制糖皮質(zhì)激素發(fā)揮活性的酶）的表達。

針對CBG包被分布在WAT細胞周圍發(fā)揮何種功能，有如下猜想[53]。（1）可能作為一種保護性屏障，通過結合親和力與含量的變化調(diào)節(jié)這種“門控”作用，抑制GCs與脂肪細胞的識別結合，限制GCs進入脂肪細胞。（2）游離脂肪酸與CBG結合可能調(diào)控了CBG與皮質(zhì)酮的結合能力。脂肪細胞內(nèi)GCs與受體結合會引起脂解反應，釋放非酯化脂肪酸進入間隙后入血，較高濃度的不飽和脂肪酸增強皮質(zhì)酮與CBG的結合力，但飽和脂酸降低二者結合力。（3）“CBG層”可能構成調(diào)節(jié)GCs作用于白色脂肪細胞的反饋環(huán)，并且通過改變CBG的合成及內(nèi)化速率來加強這種反饋調(diào)節(jié)。這些猜想認為WAT周圍的CBG環(huán)是一種保護系統(tǒng)，在脂肪分解加強的情況下降低WAT對GCs的敏感性，以減少不必要的脂肪儲備[55]。

肥胖者的應激反應往往更強，且HPA軸的功能通常發(fā)生改變，其中GCs是肥胖發(fā)生和維持的重要因素。OUSOVA等[56]提出，CBG基因是皮質(zhì)醇水平和肥胖易感性的關鍵調(diào)節(jié)因子，人血漿CBG水平被視為胰島素分泌的標志物，胰島素能夠抑制CBG的表達，且CBG與胰島素抵抗密切相關[18,57-58]。因此，CBG很可能在GCs驅動下的代謝紊亂中有重要作用[59]。

5 CBG在肝外組織表達的功能

除了上述提到的組織外，CBG在肺、子宮內(nèi)膜、胎盤、腎上腺、腎臟等組織器官中也表達[60-64]。CBG在不同組織中的表達可能發(fā)揮某些同類功能。（1）膜受體：使用高純度的125I-CBG作為探針，發(fā)現(xiàn)CBG與由人前列腺組織制備的膜有特異性結合，且這種結合是時間和溫度依賴性的（與37 ℃相比，在4 ℃和23 ℃時的結合可以忽略不計），Ca2+與Mg2+是結合的必要條件，其他血漿蛋白不結合該膜受體[37]。在其他組織膜上也得到了類似的結果，如孕酮-CBG復合物能夠特異性結合人的子宮內(nèi)膜[65]；在人肝細胞的質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)了識別和特異性結合天然CBG-皮質(zhì)醇復合物的結合位點[66-67]；胎盤細胞質(zhì)膜上也有CBG的特異性結合位點，且膜結合受糖蛋白分子構象及其碳水化合物鏈結構的影響[68]；在心肌細胞膜上有明顯的CBG免疫反應性[46]。這種特異性的CBG膜受體可能有著激活第二信使、內(nèi)化CBG-類固醇激素復合物、釋放用于局部遞送的類固醇、介導GCs的快速非基因組效應等作用[69]。（2）生物標志物：血液CBG作為急性期蛋白，其變化（特別是CBG的蛋白水解）可作為炎癥早期癥狀發(fā)生前和炎癥發(fā)作嚴重程度的重要生物標志物[70]。此外，心肌CBG在預測心血管風險、腦脊液CBG在預測壓力相關抑郁癥風險、遺傳變異CBG在識別慢性疲勞綜合癥風險以及監(jiān)測潛在有類固醇過量風險等診斷中可能具有重要價值[49]。（3）性別二態(tài)性：在腎上腺、肺等中發(fā)現(xiàn)與肝臟相反的CBG二態(tài)性[62,65]，在糖耐受實驗中發(fā)現(xiàn)CBG的表達具有性別二態(tài)性，女性表現(xiàn)出較低的CBG水平，且與高脂肪含量呈更強的相關性[71-72]。

6 結語

CBG在多種組織中有表達，除了經(jīng)典的血漿作用外，已有大量有關其組織特異性效應的報道，但是有關CBG在組織中廣泛分布的真正生理意義的報道很少。本文總結了CBG的相關背景及其肝外組織表達研究進展，CBG在局部炎癥應激反應、GCs水平調(diào)控、孕酮轉運、能量代謝等過程中很可能充當重要角色，針對CBG如何選擇性結合GCs和MCs、CBG是否參與到GCs的非基因組途徑、CBG的膜受體存在的共有或特異功能等問題仍有很大挖掘潛力。因此，可從多角度著手，以GCs在某個組織的作用為出發(fā)點，結合不同組織的特異性功能及病理生理學特征，進一步探索CBG的功能。