DPPH體系優(yōu)化及無花果黃酮清除自由基性能研究

楊程宇，梁熳珊，黃春怡，黎金英，金元寶

（珠海科技學(xué)院 藥學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣東珠海 519041）

無花果（Ficus caricaLinn.）為?？坡淙~小喬木，分布廣泛。現(xiàn)代研究表明，無花果能夠有效清除自由基、保護(hù)機(jī)體生物大分子，具有抗腫瘤、抗動脈硬化以及調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。無花果中的黃酮類化合物具有很好的化學(xué)活性，可以抗氧化、抗衰老和預(yù)防心血管疾病，且不同品種清除自由基的能力有所不同。

目前抗氧化的評價方法較多，例如DPPH法、ORAC法、ABTS法以及羥自由基法等體外研究方法[1]。其中，DPPH法在化學(xué)、中藥學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的抗氧化作用的研究上應(yīng)用廣泛，大部分學(xué)者都采用DPPH法對黃酮的抗氧化性能進(jìn)行研究[2]。雖然DPPH法已經(jīng)相當(dāng)成熟，但是現(xiàn)實情況下，不同操作人所面臨的實驗室溫度、實驗時間長短、是否避光等實際操作條件皆有不同，因此測量后得到的結(jié)果也有很大差異，導(dǎo)致DPPH法的重復(fù)性差[3-4]。

郭英等[5]對無花果品種進(jìn)行了系統(tǒng)研究，將其分為波姬紅、布蘭瑞克、中國無花果等品種。本實驗以無花果中的青皮、波姬紅、布蘭瑞克品種為樣品，對其黃酮提取物進(jìn)行DPPH清除活性研究，并對其是否避光、實驗溫度、實驗時間的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，對DPPH清除活性的評價具有重要意義[6]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

青皮無花果，山東威海耐心果園；波姬紅無花果，廣東東莞憶品香水果店；布蘭瑞克無花果，山東臨沂綠佳合作社。

DPPH，色譜級，飛凈科研試劑公司；無水乙醇，分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；蘆丁，色譜級，中國食品藥品監(jiān)督管理局；石油醚，分析純，沸點(diǎn)30～60 ℃，天天津市欣寬福利化工廠；硝酸鋁，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；亞硝酸鈉，分析純，天津市登科化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，天津市迪恩化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2800型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；XH-300A微波超聲波組合萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；FA2004N電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；EYE-LA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化株式會社；L-01冷凍干燥機(jī)，上海東方龍科技有限公司。

1.2 樣品制備

1.2.1 無花果中提取總黃酮的樣品制備

無花果（青皮、波姬紅、布蘭瑞克）用75%的乙醇擦洗并切片，然后冷凍干燥、粉碎和過40目篩，接著使用石油醚通過索氏提取法脫脂，最后干燥并儲存在干燥柜中，備用。準(zhǔn)確稱取（1.00±0.02）g無花果樣品，按實驗設(shè)計加入對應(yīng)濃度的乙醇，攪拌均勻，在黑暗中靜置60 min，通過超聲-微波法提取無花果中的黃酮化合物，具體工藝條件見表1。

表1 無花果黃酮提取工藝

將無花果總黃酮提取物凍干成粉末狀，精密稱?。?.175±0.002）g凍干粉末，使用40%乙醇溶液定容至25.0 mL容量瓶，搖勻后得樣品溶液。

1.2.2 0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液的制備

在電子分析天平上精確稱取0.003 9 gDPPH粉末，并用無水乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶，配置成0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3 黃酮提取率測定

精密稱取50.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，40%乙醇定容到50.0 mL，得到對照品母液，無花果中黃酮的檢測采用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉顯色法，在紫外分光光度計的510 nm波長下測量吸光度，以40%的乙醇溶液作參比[7-8]。通過線性回歸處理得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性方程為y=4.457 2x+0.410 2，R2為0.999 9。無花果中黃酮提取率的計算公式如下：

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 無花果提取物清除DPPH反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.4.1 反應(yīng)時間

取0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液4.0 mL，加入按照表1條件提取的青皮無花果黃酮提取物溶液1.0 mL，在25 ℃條件下避光，測試其在510 nm的吸光度，每隔5 min測定1次，連續(xù)12次，平行實驗3次，計算平均值和RSD，依據(jù)以下公式計算DPPH清除能力[9-10]：

式中：Ai為無花果總黃酮提取物+0.1 mmol/L DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度；Aj為無花果總黃酮提取物+無水乙醇溶液反應(yīng)后的吸光度；A0為無水乙醇溶液+0.1 mmol/L DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.4.2 光照條件

取0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液4.0 mL，加入按照表1條件提取的青皮無花果黃酮溶液1.0 mL，室溫條件25 ℃，分別在避光和實驗室的自然光條件下反應(yīng)，反應(yīng)30 min后，以無水乙醇為空白對照，測定510 nm處的吸光度，平行實驗3次，計算平均值和RSD，依據(jù)公式（2）計算DPPH清除能力。

1.4.3 反應(yīng)溫度

取0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液4.0 mL，加入按照表1條件提取的青皮無花果黃酮提取物溶液1.0 mL，避光，分別于4 ℃和25 ℃反應(yīng)條件下放置30 min，測定510 nm處的吸光度，平行實驗3次，計算平均值和RSD，依據(jù)公式（2）計算DPPH清除能力。

1.5 無花果提取物清除DPPH性能研究

加入按照表1條件提取的無花果黃酮提取物凍干粉，用無水乙醇溶解，稀釋得到濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的樣品液。接著，加入4.0 mL的0.1 mmol/L DPPH-CH2CH3OH反應(yīng)，置于25 ℃暗處反應(yīng)30 min。最后，使用紫外分光光度計測定其在510 nm處的吸光值，用無水乙醇作參比，重復(fù)3次，計算平均值、RSD值，DPPH清除率按公式（2）計算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過軟件IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算提取率；采用Origin 2019繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無花果總黃酮含量

3個品種的無花果分別使用表1的條件提取黃酮，使用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉顯色法，在紫外分光光度計的510 nm波長下測量吸光度，結(jié)果表明波姬紅品種無花果可以提取到的黃酮含量最大，提取率最高，其次是青皮品種和布蘭瑞克品種。

表2 無花果中黃酮含量

2.2 無花果提取物清除DPPH反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)時間

如圖2所示，前30 min內(nèi)，清除自由基能力上升較快，30～60 min清除能力上升速率較為緩慢，清除能力的差異并不明顯，因此考慮到時間成本的問題，反應(yīng)時間30 min為最佳選擇。

圖2 反應(yīng)時間對無花果提取物DPPH清除能力的影響

2.2.2 光照條件

由表3結(jié)果可知，自然光下無花果提取物對DPPH平均清除能力（55.59%）明顯高于避光條件下的平均清除能力（47.83%）。但是，避光條件下實驗結(jié)果RSD=0.23%（n=3），在自然光條件下則為RSD=1.50%（n=3），這主要是因為DPPH溶液在避光條件下更穩(wěn)定，因此本次實驗仍選擇在避光條件下進(jìn)行。

表3 光照對無花果提取物DPPH清除能力的影響

2.2.3 反應(yīng)溫度

實驗室室溫為25 ℃，而DPPH的最佳保存條件為冷藏環(huán)境4 ℃，因此設(shè)置這兩個溫度來進(jìn)行對比實驗。由表3可知，25 ℃條件下無花果提取物的清除能力明顯較高，而且在25 ℃條件下進(jìn)行實驗，有助于簡化實驗條件，因此本實驗選擇25 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

表4 反應(yīng)溫度對無花果提取物DPPH清除能力的影響

2.3 無花果提取物清除DPPH能力比較

如圖3所示，無花果提取物（黃酮）的濃度越高，樣品對應(yīng)的清除能力越強(qiáng)。表5數(shù)據(jù)表明，提取物濃度相同時，布蘭瑞克無花果的DPPH清除能力最大。

圖3 無花果品種對DPPH自由基清除能力的影響

表5 不同品種的無花果黃酮提取物對DPPH清除率的回歸方程

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，DPPH在25 ℃避光條件下，反應(yīng)時間30 min時，無花果提取物-DPPH反應(yīng)體系較為穩(wěn)定，適合實驗研究。青皮、波姬紅、布蘭瑞克提取物（總黃酮）對DPPH的清除率的線性回歸方程分別是：y=0.575x+0.123，y=0.585x+0.101，y=0.620x+0.158，R2均大于0.994。