靈芝深層發(fā)酵工藝優(yōu)化及中藥雙向發(fā)酵

何偉，于淼，彭超，袁愷，朱威宇，丁子元，江俊杰，周衛(wèi)強(qiáng)*

（1.中糧生物科技（北京）有限公司，北京 102209；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；3.北京百奧茵諾生物科技有限公司，北京 102209）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬于真菌門(mén)、多孔菌 目、靈芝菌科、靈芝屬，是一種大型藥用真菌，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。由于靈芝能預(yù)防或治療多種疾病，在古代曾被稱(chēng)為“仙草”[2]。《本草綱目》中記載，靈芝可分為赤芝、黑芝、青芝、白芝、黃芝和紫芝等，其中赤芝和紫芝在2000年被《中華人民共和國(guó)藥典》首次收錄，具有“補(bǔ)氣安神，止咳平喘”的功能[3]。近年來(lái)，中國(guó)、東南亞國(guó)家及美國(guó)等地的許多學(xué)者對(duì)靈芝進(jìn)行了深入研究，研究結(jié)果表明靈芝中含有如多糖、三萜、甾醇、核酸、蛋白質(zhì)、多肽和脂肪酸等活性物質(zhì)，其中靈芝多糖和靈芝三萜類(lèi)這兩類(lèi)物質(zhì)含量占比最高，同時(shí)也是靈芝具有藥效的主要成分[4]。

靈芝液體深層發(fā)酵是通過(guò)將靈芝真菌接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使得靈芝在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并代謝合成一些生物活性成分，如多糖、靈芝酸等物質(zhì)[5-6]。現(xiàn)代研究表明靈芝發(fā)酵液中富含多糖、靈芝酸等生物活性成分，常被用于保健品、化妝品領(lǐng)域[7-8]。

靈芝中藥雙向發(fā)酵技術(shù)是指以藥用真菌靈芝菌為發(fā)酵菌株，將含有一定活性成分中藥材作為發(fā)酵基質(zhì)[9]。中藥既能提供真菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，又能受到真菌中酶的作用改變中藥自身成分，從而使整個(gè)發(fā)酵作用具有雙向性[10]。在靈芝培養(yǎng)過(guò)程中，添加適量的中藥材，如黃芪、山藥、當(dāng)歸和薏米仁等，可以提高靈芝發(fā)酵的水平，從而促進(jìn)靈芝發(fā)酵積累多種多量的生物活性物質(zhì)[11-12]。眾多研究表明，靈芝菌作為雙向發(fā)酵菌種具有很強(qiáng)的優(yōu)越性，以中藥提取物、中藥粉末或中藥殘?jiān)鼮榛|(zhì)，以靈芝為發(fā)酵菌株進(jìn)行組合發(fā)酵，能改變發(fā)酵體系中活性成分的含量和組成[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌，保藏號(hào)：CICC14020、CICC14023。

玉米粉、淀粉，中糧生物科技股份有限公司；黃芪、當(dāng)歸、山藥以及薏米仁，亳州市佗藥堂藥業(yè)有限公司；土豆粉，食品級(jí)，浙江中好邢食品添加劑有限公司。

葡萄糖，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨、棉子蛋白胨、大豆蛋白胨以及酵母膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MaSO4·7H2O、K2HPO4，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T&J Btype型發(fā)酵罐，迪必爾生物工程（上海）有限公司；HZQ-F160型振蕩培養(yǎng)箱，常州杰博森儀器有限公司；IMH100-SSS型恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)ThermoFisher Scientific；SCB-1360超級(jí)潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HWS28水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；X3R離心機(jī)，美國(guó)ThermoFisher Scientific；UV-1750紫外分光光度計(jì)，日本島津；SX-700高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 固體培養(yǎng)基

采用土豆粉作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，制備PDA固體平板培養(yǎng)基。

1.3.2 種子液培養(yǎng)基

葡萄糖35 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L以及維生素B10.1 g/L。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

（1）發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖35 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂1.0 g/L以及維生素B10.1 g/L。

（2）碳源篩選所用培養(yǎng)基。碳源以同等碳元素計(jì)分別選擇葡萄糖、玉米粉液化液、玉米淀粉液化液以及玉米淀粉糖化液。

（3）氮源篩選所用培養(yǎng)基。氮源以同等氮元素計(jì)分別選擇蛋白胨、酵母粉、蛋白胨和酵母粉復(fù)配、大豆蛋白胨、棉子蛋白胨以及酵母膏。

（4）碳氮比篩選所用培養(yǎng)基。固定碳元素含量，通過(guò)變化培養(yǎng)基中氮元素含量調(diào)整不同碳氮比，3種碳氮質(zhì)量比分別為 15、 30和40。

（5）發(fā)酵條件優(yōu)化所用培養(yǎng)基。葡萄糖35 g/L、酵母粉2.5 g/L、蛋白胨2.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂1.0 g/L以及維生素B10.1 g/L。

（6）中藥培養(yǎng)基。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基上分別添加黃芪、山藥、當(dāng)歸或薏米仁各10 g/L。

1.4 靈芝菌種培養(yǎng)

1.4.1 平板菌種培養(yǎng)

取出保藏的菌種，在試管或平板上挑取一小塊帶有菌絲的瓊脂放在新的培養(yǎng)基上，并在平板上標(biāo)明接種日期和菌種編號(hào)放在（28±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d左右。

1.4.2 種子液培養(yǎng)

從平板上挑取1 cm×1 cm大小的菌塊，接種到搖瓶培養(yǎng)基中并加入配好的維生素B1溶液。將接種好的三角瓶放在28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)7 d左右，得到成熟的種子液。

1.5 靈芝發(fā)酵工藝流程

靈芝發(fā)酵工藝流程圖如圖1所示。

圖1 發(fā)酵工藝流程圖

1.6 靈芝多糖檢測(cè)

1.6.1 靈芝多糖的提取

采用乙醇溶劑對(duì)靈芝多糖進(jìn)行提取[15]。

1.6.2 檢測(cè)方法

采用硫酸-苯酚法進(jìn)行顯色反應(yīng)對(duì)靈芝多糖進(jìn)行檢測(cè)，以無(wú)水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[16]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=8.233 3x-0.000 6，其中y表示吸光度，x表示靈芝多糖含量（g/L），R2=0.999 5。

1.7 靈芝酸檢測(cè)

1.7.1 靈芝三萜的提取

提取溶劑為正丁醇、料液比為1∶3（v∶v）、超聲溫度為50 ℃、超聲時(shí)間為40 min及超聲功率為120 W[17]。

1.7.2 檢測(cè)方法

采用香草醛-冰醋酸顯色反應(yīng)對(duì)靈芝酸進(jìn)行檢測(cè)，以齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[18]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.910 2x-0.022 2，其中y表示吸光度，x表示靈芝酸含量（g/L），R2=0.999 6。

1.8 生物量檢測(cè)

取發(fā)酵液樣品35 mL與50 mL于離心管內(nèi)，8 000 r/min離心10 min，倒去上清液，加入純水充分混勻后再離心棄去上清液，重復(fù)此步驟2次，得到濕菌體，再將其放入80 ℃烘箱中烘24 h，對(duì)干菌體進(jìn)行稱(chēng)重。

2 結(jié)果分析

2.1 不同碳源對(duì)靈芝發(fā)酵的影響

如表1所示，葡萄糖作為碳源時(shí)，干重含量最少，而玉米粉液化液作為碳源時(shí)，干重含量最高，這是因?yàn)橛衩追垡夯褐泻杏衩追垲w粒，有利于靈芝菌絲的吸附生長(zhǎng)，從而使得靈芝菌生長(zhǎng)條件更好；淀粉液化液和淀粉糖化液的區(qū)別在于，糖化液中的還原糖占比高于液化液中的還原糖占比，在干重方面兩者的影響差別不大；與單一的葡萄糖作為碳源相比，淀粉作為碳源時(shí)會(huì)促進(jìn)靈芝菌體的生長(zhǎng)。

表1 不同碳源對(duì)靈芝發(fā)酵的影響

從靈芝多糖含量的對(duì)比來(lái)看，玉米粉液化液作為碳源時(shí)，靈芝多糖含量相對(duì)較高；與葡萄糖相比，淀粉液化液作為碳源時(shí)，靈芝多糖含量相對(duì)較低。淀粉液化液與葡萄糖作為碳源，淀粉液化液中除含有葡萄糖外，還含有未被分解的二糖、三糖、糊精等物質(zhì)，這些物質(zhì)在靈芝生長(zhǎng)過(guò)程中不被或者較難被利用，使得淀粉液化液作為碳源進(jìn)行發(fā)酵的效果亞于葡萄糖作為碳源；相比淀粉，玉米粉液化后還具有多種微量元素，而這些微量元素可促進(jìn)靈芝多糖的合成。

從靈芝酸整體來(lái)看，玉米粉液化液作為碳源時(shí)，靈芝酸含量最高；而以淀粉液化液和淀粉糖化液作為碳源時(shí)靈芝酸含量與葡萄糖作為碳源時(shí)的靈芝酸含量相近。

2.2 不同氮源對(duì)靈芝發(fā)酵的影響

如圖2所示，從靈芝多糖含量來(lái)看，以酵母粉作為對(duì)照氮源，其中蛋白胨、棉子蛋白胨、大豆蛋白胨作為替代氮源與酵母粉的作用效果無(wú)明顯差別；但酵母粉和蛋白胨復(fù)配后氮源與酵母粉相比，其對(duì)靈芝多糖的積累有促進(jìn)作用；酵母膏作為氮源時(shí)不利于靈芝多糖的合成。

圖2 不同氮源對(duì)靈芝發(fā)酵的影響

從靈芝酸含量來(lái)看，以酵母粉作為對(duì)照氮源，其中蛋白胨、酵母粉蛋白胨復(fù)合氮源、酵母膏、棉子蛋白胨以及大豆蛋白胨對(duì)靈芝酸都有促進(jìn)作用，尤其是大豆蛋白胨作為氮源時(shí)對(duì)靈芝酸的積累促進(jìn)作用更大。

2.3 不同碳氮比對(duì)靈芝發(fā)酵影響

如圖3、4所示，從多糖指標(biāo)出發(fā)，兩株靈芝菌都表現(xiàn)出碳氮比太高或太低都會(huì)出現(xiàn)多糖含量少的情況；從干重來(lái)分析，都表現(xiàn)出隨碳氮比的增加干重含量也減少的趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)楫?dāng)碳氮比太高時(shí)，氮源含量較少，不足以提供靈芝生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，導(dǎo)致靈芝菌體生長(zhǎng)受限，從而導(dǎo)致菌體生物量和靈芝多糖的合成都會(huì)減少；當(dāng)碳氮比太低時(shí)，碳源含量一定的情況下，氮源含量較多，對(duì)靈芝發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，導(dǎo)致靈芝一直處于生長(zhǎng)旺盛期，干重較高，相對(duì)之下靈芝多糖的合成減少。

圖3 不同碳氮比對(duì)終點(diǎn)多糖影響

圖4 不同碳氮比對(duì)終點(diǎn)干重影響

2.4 不同溶氧條件對(duì)靈芝發(fā)酵影響

發(fā)酵終點(diǎn)各參數(shù)數(shù)據(jù)如表2所示，從整體發(fā)酵周期來(lái)看，溶氧條件的變化對(duì)靈芝發(fā)酵周期影響很大，溶氧控制在20%時(shí)相對(duì)于不控制溶氧（對(duì)照）條件，發(fā)酵周期縮短67.5 h；對(duì)于靈芝多糖的影響，控制溶氧在10%以上時(shí)相對(duì)對(duì)照靈芝多糖含量有所增加，尤其是溶氧控制在20%時(shí)，靈芝多糖含量達(dá)到2.185 g/L，相比對(duì)照增加了0.818 g/L。通過(guò)生物量的變化可以發(fā)現(xiàn)，溶氧條件對(duì)靈芝菌體的生長(zhǎng)影響很大，尤其是在溶氧條件不足的情況下，例如4#不控溶氧條件下，其菌體干重含量最少，而靈芝菌作為一種好氧真菌在缺氧的情況下會(huì)使其生長(zhǎng)代謝受到影響，導(dǎo)致生長(zhǎng)受限；從靈芝酸的變化來(lái)看，溶氧條件的變化對(duì)于靈芝酸的含量影響不大。

表2 發(fā)酵終點(diǎn)各參數(shù)

如圖5所示，從靈芝多糖的變化趨勢(shì)上來(lái)看，對(duì)照和控制溶氧條件對(duì)比，溶氧在10%以上時(shí)其多糖的變化趨勢(shì)基本在同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，而不控溶氧條件下的多糖變化在前期變化緩慢，到發(fā)酵中后期才有積累的趨勢(shì)；幾個(gè)溶氧條件下，溶氧控制在20%左右時(shí)其靈芝多糖積累最多。

圖5 不同溶氧條件下靈芝多糖變化趨勢(shì)

2.5 不同中藥成分對(duì)靈芝發(fā)酵的影響

2.5.1 不同中藥成分對(duì)靈芝多糖含量的影響

如圖6所示，分別添加黃芪、當(dāng)歸、山藥以及薏米仁4種中藥各10 g/L與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)黃芪、山藥、當(dāng)歸和薏米仁這幾種中藥對(duì)靈芝多糖的積累都有促進(jìn)作用，尤其是黃芪作為中藥基質(zhì)添加到培養(yǎng)基中對(duì)靈芝多糖的促進(jìn)效果更明顯，使得靈芝多糖達(dá)到7.914 g/L，相比對(duì)照增加3.445 g/L。

圖6 不同中藥成分對(duì)靈芝多糖含量的影響

2.5.2 不同中藥成分對(duì)靈芝酸含量的影響

如圖7所示，黃芪、當(dāng)歸、山藥以及薏米仁幾種中藥的添加對(duì)靈芝酸的積累都具有促進(jìn)作用，尤其是黃芪的添加對(duì)其作用效果更為明顯。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 g/L的黃芪可以促進(jìn)靈芝酸的積累，使靈芝酸含量達(dá)到0.28 g/L，同比對(duì)照增加0.16 g/L，而其他3種中藥對(duì)于靈芝酸的促進(jìn)作用較小。

圖7 不同中藥對(duì)靈芝酸的影響

3 結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到酵母粉和蛋白胨復(fù)配作為氮源有利于靈芝多糖和靈芝酸的積累；玉米粉、葡萄糖作為碳源有利于靈芝多糖和靈芝酸的積累；通過(guò)碳氮比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了C∶N（質(zhì)量比）為30時(shí)更有利于靈芝發(fā)酵；發(fā)酵過(guò)程中，溶氧條件控制在20%左右時(shí)有利于靈芝發(fā)酵指標(biāo)的增長(zhǎng)；添加中藥物質(zhì)黃芪、當(dāng)歸、山藥或薏米仁對(duì)于靈芝發(fā)酵都有促進(jìn)作用，其中添加黃芪的發(fā)酵液中，靈芝多糖和靈芝酸含量都相對(duì)較高，而當(dāng)歸、山藥、薏米仁3種中藥相對(duì)于黃芪對(duì)靈芝多糖和靈芝酸的促進(jìn)作用相對(duì)較弱。本文主要研究了靈芝多糖和靈芝酸的生產(chǎn)方法，為靈芝產(chǎn)物在生產(chǎn)中提供幫助；同時(shí)中藥物質(zhì)的添加，能促進(jìn)靈芝中活性成分的增加，大大推動(dòng)了靈芝發(fā)酵液在保健品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。希望通過(guò)本文研究，為“中藥雙向發(fā)酵技術(shù)”的開(kāi)發(fā)提供幫助。