女貞子制備紅景天苷的工藝研究

楊陽，劉凱華，潘朝，張良明，李超敏

（西安天一生物技術(shù)股份有限公司，陜西西安 710000）

女貞子為木犀科植物女貞的干燥成熟果實(shí)，味甘苦、性涼，歸肝經(jīng)和腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎、滋陰清熱、涼血明目等功效[1]。含有三萜類（齊墩果酸等）、環(huán)烯醚萜類（女貞苷、女貞子苷、橄欖苦苷等）、苯乙醇類（紅景天苷、北升麻寧等）、黃酮類等化合物及豐富的揮發(fā)油、脂肪酸、糖類、氨基酸、微量元素和甾醇類等多種活性成分[2]。女貞在我國分布廣泛，用女貞子提取紅景天苷比起資源貧乏的紅景天獲取更加容易且價格低[3]。本文以女貞子為原料，經(jīng)水提取后鹽酸水解環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定提取、水解方法及樹脂純化選型等以提高紅景天苷含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AT液相色譜儀，日本島津；SPD-20A檢測器，LabSolutions化學(xué)工作站；SQP電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，天津華鑫儀器廠；DZTW調(diào)溫電熱套，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；BO-150T粉碎機(jī)，永康鉑歐高速多功能粉碎機(jī)。

紅景天苷對照品，批號110818-202009，中國食品藥品檢定研究院；AB-8大孔樹脂，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司；甲醇為色譜純，蒸餾水、超純水，自制；其他所用試劑和溶劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜法測定

（1）色譜條件。色譜柱：島津Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：15%甲醇水溶液；檢測波長為275 nm；流速：1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL[4]。

（2）對照品溶液的制備。精確稱取紅景天苷對照品5.07 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即得。

（3）線性關(guān)系。精密量取紅景天苷對照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL和10 μL，注入液相色譜儀。按1.2.1（1）項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=654 580X+5 099.2，R2=0.999，表明紅景天苷在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（4）供試品溶液制備。提取液：取一定體積液體，濾過，取續(xù)濾液，稀釋至適當(dāng)濃度即得。提取物：精密稱取女貞子提取物20 mg，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 提取方法

女貞子原料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后通過國家標(biāo)準(zhǔn)的R40/3系列下二號篩，準(zhǔn)確稱取一定量置于錐形瓶中，按下列方式提取。

（1）提取溶劑分別為60%乙醇、75%乙醇、90%乙醇、水，料液比（mL∶g）為25∶1，提取時間為2 h。（2）提取溶劑為水，料液比（mL∶g）分別為7∶1、15∶1、25∶1，提取時間為2 h。（3）提取溶劑為水，料液比（mL∶g）為25∶1，提取時間分別為1 h、2 h、3 h。

單因素點(diǎn)提取液過濾，醇液需濃縮至無醇，分別加2%（原料質(zhì)量）鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%），在85 ℃水浴中水解1 h，然后用NaOH調(diào)至中性，待冷卻至常溫后，記體積備用，按1.2.1（1）中色譜條件檢測其濃度，計算女貞子中紅景天苷得率，公式為：

式（1）中w表示紅景天苷得率，%；c為紅景天苷濃度，mg/mL；v為液體體積，mL；m為稱取的女貞子質(zhì)量，g。

分別對上述提取方法中的提取溶劑、液料比、提取時間3個影響因素進(jìn)行單因素考察，確定最佳提取方法。

1.2.3 水解方法

準(zhǔn)確量取一定體積的女貞子水提溶液置于錐形瓶中，按下列方式水解。

（1）水解溫度分別為60 ℃、85 ℃、100 ℃，加入原料質(zhì)量3%的鹽酸，水解2 h。（2）水解溫度為85 ℃，分別加入原料質(zhì)量1%、2%、3%的鹽酸，水解時間為1 h。（3）水解溫度為85 ℃、加入原料質(zhì)量3%的鹽酸，水解時間分別為0.5 h、1.0 h和2.0 h。

單因素點(diǎn)分別用NaOH調(diào)至中性，待冷卻至常溫后，記體積備用，按1.2.1（1）中色譜條件檢測其濃度，根據(jù)式（1），計算女貞子中紅景天苷得率。分別對上述水解方法中的水解溫度、鹽酸加入量、水解時間3個影響因素進(jìn)行單因素考察，確定最佳水解方法。

1.2.4 樹脂純化

（1）靜態(tài)吸附確定上樣量及上樣pH值。準(zhǔn)確量取一定體積女貞子提取水解中和液，置于250 mL具塞錐形瓶中，在不同pH值條件下，加入處理好的一定質(zhì)量的大孔樹脂，水浴鍋振搖4 h，然后靜置20 min，測定濃度。根據(jù)液體吸附前后濃度計算吸附量，確定最適上樣樹脂及上樣pH值[5]。

（2）樹脂上樣原料質(zhì)量的確定。準(zhǔn)確稱取100 g經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后通過國家標(biāo)準(zhǔn)的R40/3系列下二號篩的女貞子原料，根據(jù)最佳提取方法和水解方法，制備上樣液。取100 g A8-8樹脂裝柱，提取液上柱，上樣流速為1 BV/h，每240 mL收集1次，共收集6份，精確吸取每份各10 μL注入高效液相色譜，檢測收集液紅景天苷濃度，以紅景天苷濃度和收集次數(shù)作泄露曲線，確定上樣質(zhì)量。

（3）洗脫溶劑的選擇。取100 g原料制備樣液以2 BV/h的流速通過裝有AB-8大孔樹脂的層析柱，然后用8 BV水、8 BV 10%乙醇、8 BV 20%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，檢測含量，確定最佳洗脫溶劑[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對紅景天苷得率的影響

2.1.1 提取溶劑對得率的影響

提取溶劑對紅景天苷得率的影響如圖1所示。結(jié)果表明75%乙醇提取和生活用水提取相差不大，考慮到生產(chǎn)成本及后續(xù)鹽酸水解，選擇水作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑的考察

2.1.2 不同料液比對得率的影響

液料比對紅景天苷得率的影響如圖2所示，料液比從7∶1增大到15∶1，紅景天苷得率上升，繼續(xù)增大料液比得率變化不明顯。從提取效率及經(jīng)濟(jì)角度選擇15∶1（mL∶g）的料液比。

圖2 料液比的考察

2.1.3 提取時間對得率的影響

提取時間對得率的影響如圖3所示，結(jié)果表明提取時間為2 h時，能將大部分環(huán)烯醚萜類和紅景天苷提取出來，因此選擇提取時間為2 h。

圖3 提取時間的考察

2.2 水解方法對紅景天苷得率的影響

2.2.1 水解溫度對得率的影響

水解溫度對紅景天苷得率的影響如圖4所示，溫度低水解不徹底，溫度高可能使生成的苷元發(fā)生聚合反應(yīng)，從而影響紅景天苷含量，結(jié)果表明水解溫度應(yīng)選擇85 ℃。

圖4 水解溫度的考察

2.2.2 鹽酸加入量對得率的影響

鹽酸加入量對得率的影響如圖5所示，鹽酸加入量少（1%）影響水解效果，加入多（3%）效果提升不明顯，同時為了防止聚合反應(yīng)的發(fā)生，選擇加入原料質(zhì)量2%的鹽酸。

圖5 鹽酸加入量的考察

2.2.3 水解時間對得率的影響

水解時間對得率的影響如圖6所示，結(jié)果表明環(huán)烯醚萜類化合物1 h即可完成水解，繼續(xù)延長時間沒有意義。

圖6 水解時間的考察

2.3 樹脂優(yōu)選

通過吸附實(shí)驗(yàn)（表1）可知，AB-8和LX-32在pH=5時效果較好，當(dāng)溶液pH上升到7和9，AB-8樹脂的效果明顯好于其他樹脂。因此，選用AB-8樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 pH值對4種型號大孔樹脂靜態(tài)吸附紅景天苷的影響

AB-8動態(tài)吸附泄露曲線如圖7所示，從第4份開始有明顯泄露，因此100 g樹脂能吸附720 mL提取液，即50 g原料。

圖7 紅景天苷泄露曲線

不同洗脫溶劑對紅景天苷解析率的影響見表2。由表2可知10%乙醇能洗脫大量的紅景天苷，因此選用10%乙醇作為洗脫溶劑。

表2 不同溶劑對紅景天苷的洗脫效果

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，得到提取最佳工藝條件為：在沸水回流提取前提下，料液比15∶1（mL∶g）、提取時間2 h、提取液過濾，加入2%（原料重量）鹽酸、85 ℃水解1 h、然后用NaOH調(diào)至中性，靜置、降至常溫后過濾、AB-8樹脂純化、8 BV水洗雜質(zhì)及8BV 10%乙醇洗脫，最后收集洗脫液，濃縮干燥即得女貞子提取物，由表3表明工藝穩(wěn)定可行。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本次工藝研究主要對女貞子制備紅景天苷提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)水提、鹽酸水解、大孔樹脂純化后紅景天苷的含量達(dá)到55%以上，且解析率為90%。工藝穩(wěn)定且操作簡便，對紅景天苷市場供應(yīng)不足問題提供一定的解決思路。