miR-148-5p靶向H型血管調(diào)控因子Slit3的實(shí)驗(yàn)研究

陳賽楠 黃云梅 林燕萍 黃美雅

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點(diǎn)研究室，福建 福州 350003 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122 3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122

2014年Kusumbe等[1-2]學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)小鼠長骨中存在特殊的毛細(xì)血管亞型：H型血管，其周圍富集大量Osterix+和Runx2+的骨祖細(xì)胞并且與骨形成密切相關(guān)，稱為“成血管-成骨偶聯(lián)”。研究顯示雙側(cè)卵巢切除術(shù)后小鼠骨量降低的同時伴隨H型血管和骨祖細(xì)胞數(shù)量顯著降低[3]，而促進(jìn)H型血管新生可改善骨密度和顯微結(jié)構(gòu)[4]，H型血管在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)中的作用逐漸引起學(xué)者關(guān)注。

多種血管調(diào)控因子可直接或間接調(diào)控成血管-成骨偶聯(lián)，如神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子3(Slit3)[5]和血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)[6]等，截短重組Slit3-LRRD2可緩解去卵巢小鼠骨量丟失[7]，然而PMOP骨組織中Slit3的表達(dá)變化及其上游miRNAs調(diào)控機(jī)制未見相關(guān)報道。microRNA是內(nèi)源性基因編碼的19-24nt單鏈非編碼RNA，與靶基因3′UTR堿基互補(bǔ)配結(jié)合引導(dǎo)靶基因降解或沉默，在PMOP的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[8]。本研究通過觀察去卵巢快速骨丟失大鼠H型血管調(diào)控因子Slit3的表達(dá)變化，采用miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫篩選靶標(biāo)miRNAs，雙熒光素酶報告基因驗(yàn)證其直接作用，旨在初步探討Slit3的上游調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)H型血管的深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：SPF級3月齡雌性SD大鼠20只，體重(180±20) g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證編碼：20180004027331。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號：醫(yī)動學(xué)第23-016號；通過動物倫理審查，編號：FJATCM-IAEC2021004，本次實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2細(xì)胞株和質(zhì)粒：293 T人腎胚細(xì)胞(SunBio)、DH5a感受態(tài)細(xì)胞(Takara)、psiCHECK-2質(zhì)粒(SunBio)、miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p、miR-374-5p、miRNA-NC過表達(dá)質(zhì)粒(吉瑪基因)。

1.1.3主要試劑與儀器：通用SP檢測試劑盒(Solarbio)、EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)、SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11718)、Anti-Slit3 antibody(abcam, ab198726)、Anti-VEGFA antibody(abcam, ab231260)、Opti-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)、胎牛血清(BI)、胰酶(Invitrogen)、PrimeSTAR、Taq酶、dNTP(Takara)、無縫克隆試劑盒(SunBio)、限制性內(nèi)切酶XhoI(NEB)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Takara)、小抽試劑盒(Promega)、Lipo2000 Transfection Reagent(Invitrogen)、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)、Real-time PCR(ABI，7500 Fast)、全自動石蠟切片機(jī)(Leica，RM2255)、熒光倒置顯微鏡(Leica，DMI 4000B)、CO2培養(yǎng)箱(ESCO，CCL-240B-8)、酶標(biāo)儀(Tecan，Infinite M1000)。

1.2 方法

1.2.1大鼠快速骨丟失模型制備：20只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，每組10只，采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)制備模型，術(shù)前一日大鼠禁食不禁水，稱重，2%戊巴比妥鈉按照0.2 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉，腹部備皮，于腹部正中線作一長約1.5 cm的切口，打開腹腔沿子宮尋找雙側(cè)卵巢，結(jié)扎并摘除，逐層縫合；假手術(shù)組采用相同方法切除卵巢周邊等量的脂肪組織；術(shù)后3 d連續(xù)肌注青霉素8萬單位/d，預(yù)防感染。術(shù)后12周取脛骨和腰椎備檢。

1.2.2骨密度測量：去除脛骨周圍軟組織，生理鹽水沾濕紗布包裹并-20 ℃保存，復(fù)溫后固定掃描位置，雙能X線骨密度儀選用小動物高分辨掃描模式掃描脛骨，自選工具選定ROI區(qū)域，讀取骨密度。

1.2.3Real-timePCR檢測Slit3 mRNA表達(dá)：液氮研磨組織，骨組織RNA快速提取試劑盒提取總RNA，Nanodrop2000測其濃度，總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，-20 ℃保存；根據(jù)ncbi基因數(shù)據(jù)庫Sli3序列設(shè)計合成引物(表1)，采用SYBR Green 20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s 40個循環(huán)，72 ℃ 5 min，β-actin作為內(nèi)參計算Slit3 mRNA的相對水平。

表1 Real-time引物序列Table.1 Primer sequences for real-time PCR

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測Slit3和VEGFA表達(dá)：盡量去除脛骨周圍肌肉組織，4%多聚甲醛(pH 7.2～7.4)常溫固定72 h，10%EDTA(pH 7.2～7.4)常溫脫鈣，每3日換液至刀切無阻力感，樣本經(jīng)脫水、透明和浸蠟，石蠟包埋，選擇冠狀面為切面，4 μm厚切片，攤片，多聚賴氨酸防脫載玻片撈片和60 ℃拷片3 h；切片脫蠟至水，3%H2O2常溫10 min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗滌3次，20 μg/mL蛋白酶K 37 ℃抗原修復(fù)，PBS洗滌3次，山羊血清37 ℃封閉20 min，1∶50 Slit3和1∶50 VEGFA一抗?jié)窈? ℃分別孵育過夜，PBS洗滌3次，1∶100羊抗小鼠/兔IgG 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，1∶100鏈酶親和素-POD 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，200倍鏡下拍攝，每張切片選取12個不同視野，Image Pro Plus 6.0圖像半定量分析。

1.2.5預(yù)測靶向Slit3基因的miRNA：采用http://www.targetscan.org/vert_72/、http://mirdb.org/和http://www.mircode.org/index.php 3個miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫，輸入靶基因Slit3預(yù)測miRNA，選取數(shù)據(jù)庫交集用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/基因數(shù)據(jù)庫中檢索大鼠Slit3基因3′UTR序列NM_031 321.1，設(shè)計合成引物并引入相關(guān)酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增引物序列上游：5’-GTAATTCTAGGCGATCGCTCGAG-3′，下游：5’-GTTTAAACGAATTCCCGGG-3′；根據(jù)Slit3基因3′UTR序列與miR-148b-5p結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計點(diǎn)突變合成突變體引物，上游：5’-ATAATAA AAACGCTGCAGA TTTTTTTGTTTATTTTACAATATAC-3′，下游：5’-ACAAAAAAATCTGCAGCGTTTTTATTATGG AAAGTGACTATTT-3′；PCR反應(yīng)條件為98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，擴(kuò)增Slit3基因3′UTR野生型與突變型，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠純化回收。限制性內(nèi)切酶XhoI對psiCHECK-2質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切，回收6273bp載體片段；目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2∶1同源重組入表達(dá)載體，同源重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，Luria-Bertani平板挑取轉(zhuǎn)化子，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，轉(zhuǎn)化子保種并送測序，測序正確再接種抽提質(zhì)粒，完成Slit3基因3′UTR野生型與突變型載體構(gòu)建。

1.2.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染：293 T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備細(xì)胞懸液按30%～50%的匯合度接種于24孔板，實(shí)驗(yàn)分為4組：miRNA-NC+Slit3-3′UTR WT、miR-148b-5p+Slit3-3′UTR WT、miRNA-NC+Slit3-3′UTR mut、和miR-148b-5p+Slit3-3′UTR mut，每組設(shè)置3個復(fù)孔，種板12 h后按照RNA∶DNA∶轉(zhuǎn)染試劑=50 nmol/L∶200 ng∶3 μL比例轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h后換液。

1.2.8熒光素酶活性檢測：293 T細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后吸除原培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，吸除PBS，配置1×PLB并恢復(fù)至室溫，每孔加入1×PLB 100 μL，搖床常溫15 min裂解細(xì)胞，反復(fù)吹吸后將24孔板置于冰上；采用白色不透光96孔板用于后續(xù)檢測，每孔加入預(yù)混合LAR II 20 μL，加入細(xì)胞裂解液上清1 μL，再加入水29 μL，靜置2 s酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶活性；立即再向每孔加入預(yù)混合Stop&Glo Reagent 20 μL，靜置2 s酶標(biāo)儀檢測海腎熒光素酶活性；以螢火蟲熒光素酶為實(shí)驗(yàn)報告基因，海腎熒光素酶為對照報告基因，兩者的比值顯示Slit3基因的激活程度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 脛骨骨密度

與假手術(shù)組[(0.414 8±0.009 8) g/mm2]相比，術(shù)后12周模型組脛骨近端骨密度[(0.317 7±0.015 7) g/mm2]顯著降低，降低約24.5%(P<0.001)，提示快速骨丟失模型制備成功。

2.2 Slit3 mRNA表達(dá)水平

與假手術(shù)組(1.000±0.000)相比，模型組骨組織中Slit3 mRNA表達(dá)水平(1.126 9±0.256)略有上調(diào)，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.682)。

2.3 Slit3和VEGFA表達(dá)情況

圖1A為Slit3的陰性對照，棕黃色即為陽性表達(dá)區(qū)域；顯微鏡下可見Slit3表達(dá)于骨小梁周邊的成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，定位細(xì)胞質(zhì)；假手術(shù)組骺線下骨小梁數(shù)量多并且周徑長，然而Slit3表達(dá)強(qiáng)度較弱(圖1B)；模型組骨小梁稀疏并且髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞堆積，表達(dá)范圍較假手術(shù)組稍小(P=0.289)，然而平均光密度顯著增強(qiáng)(P=0.004)，其表達(dá)水平呈上調(diào)狀態(tài)(圖1C，表2)。VEGFA同為促血管生成因子，圖1 D為陰性對照，主要表達(dá)于骨細(xì)胞其周圍和血管內(nèi)皮細(xì)胞定位細(xì)胞質(zhì)；與假手術(shù)組相比(圖1E)，模型組(圖1F)平均光密度稍高，然表達(dá)面積較低故累計光密度略小，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表2 兩組大鼠脛骨Slit3蛋白表達(dá)情況Table.2 Expression of Slit3 in the rats tibia

表3 兩組大鼠脛骨VEGFA蛋白表達(dá)情況Table.3 Expression of VEGFA in the rats tibia

2.4 Slit3基因與miRNAs的靶向關(guān)系預(yù)測

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示去卵巢大鼠骨量和血管生成情況均降低，H型血管調(diào)控因子Slit3表達(dá)顯著上調(diào)，表明Slit3在疾病中可能發(fā)揮重要作用，因此研究其上游調(diào)控miRNAs。targetscan、miRDB和miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測大鼠Slit3基因與miRNAs的靶向關(guān)系，TargetScan預(yù)測到259個miRNAs，miRDB預(yù)測到15個miRNAs，miRcode預(yù)測到121個miRNAs；取數(shù)據(jù)庫交集并且評分高優(yōu)先，選擇最佳5個miRNAs：miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p和miR-374-5p。見圖2。

圖2 miRNAs生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果Fig.2 Results of bioinformatics prediction of miRNAs

2.5 重組雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建

LB平板挑取轉(zhuǎn)化子，瓊脂糖凝膠電泳獲得592 bp的陽性克隆，DL2000 DNA Marker自上而下為2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp，與預(yù)期設(shè)計的目的片段長度相符(圖3A)?；驕y序綠色標(biāo)記為載體序列，黃色標(biāo)記為目的基因Slit3 3'UTR序列，藍(lán)色標(biāo)記為點(diǎn)突變處，粉色標(biāo)記為酶切位點(diǎn)，結(jié)果顯示目的基因序列無突變和缺失，表明重組雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建成功(圖3B)，終載體圖譜見(圖3C)。

圖3 psiCHECK-2/Slit3-3′UTR mut和psiCHECK-2/Slit3-3′UTR WT質(zhì)粒構(gòu)建A：PCR鑒定候選轉(zhuǎn)化子；B：陽性克隆測序分析；C：質(zhì)粒載體Fig.3 Construction of psiCHECK-2/Slit3-3′UTR mut and psiCHECK-2/Slit3-3′UTR WT plasmidA: The candidate transformants were identified by PCR; B: Positive clones were chosen for sequencing; C: Plasmid vector

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

上述5個miRNAs和psiCHECK-2-Slit3-3′UTR載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，雙熒光素酶報告基因檢測其活性；與miRNA-NC對照組相比，miR-148b-5p熒光活性下調(diào)至68.91%(P=0)，miR-129-5p熒光活性下調(diào)至79.19%(P=0)，miR-148a-5p熒光活性下調(diào)至83.19%(P=0)，miR-410-3p熒光活性為92.56%，miR-374-5p熒光活性為114.99%；結(jié)果表明，miR-148b-5p對于slit3-3'UTR有一定的負(fù)調(diào)控作用，miR-148a-5p、miR-129-5p對其有微弱的負(fù)調(diào)控作用，miR-410-3p、miR-374-5p對其無明顯作用，因此選擇miR-148b-5p和slit3-3'UTR進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。見表4。

表4 熒光素酶活性比值Table.4 Results of ratio of luciferase activity

2.7 miR-148b-5p靶向調(diào)控Slit3基因表達(dá)

targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測Slit3-3′UTR和miR-148b-5p存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)，位于第147-154堿基AGAACTTA，將Slit3-3'UTR預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變構(gòu)建psiCHECK-2/Slit3-3′UTR mut質(zhì)粒，與miR-148b-5p mimic共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。與miRNA-NC+Slit3-3′UTR WT相比，miR-148b-5p+Slit3-3′UTR WT熒光活性下調(diào)至72.24%(P=0)；與miRNA-NC+Slit3-3′UTR mut相比，miR-148b-5p+Slit3-3′UTR mut的熒光活性未見降低；結(jié)果表明miR-148b-5p特異性結(jié)合Slit3-3′UTR調(diào)控其表達(dá)水平(圖4B)。

圖4 Slit3-3′UTR點(diǎn)突變后雙熒光素酶活性比值A(chǔ)：Slit3-3′UTR與rno-miR-148b-5p結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測；B：Slit3-3′UTR點(diǎn)突變后雙熒光素酶活性比值Fig.4 Ratio of dual luciferase activity after Slit3-3′UTR point mutationA: The prediction results of rno-miR-148b-5p binding sites in the Slit3-3′UTR; B: Ratio of double luciferase activity after Slit3-3′UTR point mutation

3 討論

Wang等[9]首次證實(shí)人體骨組織同樣存在H型血管，其數(shù)量與骨密度呈正相關(guān)。H型血管的表面標(biāo)記物、分布和功能區(qū)別于其他毛細(xì)血管亞型，表面血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)和內(nèi)皮粘蛋白(endomucin，Emcn)呈高表達(dá)，縱行排列交織成網(wǎng)主要分布于干骺端和骨內(nèi)膜，空間上其周邊骨祖細(xì)胞密布與骨形成緊密相關(guān)，時間上血管生成介導(dǎo)骨形成，這種時空上的緊密聯(lián)系稱“成血管-成骨偶聯(lián)”，將經(jīng)典骨重建二元調(diào)控理論豐富為“H型血管-成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞”三元調(diào)控理論。檢測絕經(jīng)后女性髖部骨折標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，H型血管數(shù)量隨骨密度降低而顯著降低[10]，并且血管面積大小與非絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨折患者間存在差異[11]，均與文獻(xiàn)報道動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合[3]；腹腔注射去鐵胺(HIF-1α激活劑)可增強(qiáng)去卵巢小鼠H型血管形成從而改善骨密度和骨顯微結(jié)構(gòu)[4]；因此有效調(diào)控H型血管或?qū)⒊蔀镻MOP治療的新方向。

1984年，Nüsslein-Volhard等[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子家族(SLIT guidance ligand，Slit)，最早作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制因子被發(fā)現(xiàn)，是高度保守的大分子分泌型糖蛋白，與靶細(xì)胞膜上的單次跨膜受體蛋白ROBO(Roundabout)家族相結(jié)合，調(diào)控神經(jīng)軸突的定向生長以阻止中線交叉[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Slit3是新型有效的促血管生成因子[14]，在骨組織等非神經(jīng)系統(tǒng)中同樣起重要作用，Slit3的rs10036727單核苷酸多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女股骨頸骨密度顯著相關(guān)[15]；Slit3OSX小鼠出現(xiàn)H型血管數(shù)量減少和骨量降低；采用Slit3重組蛋白干預(yù)去卵巢小鼠，提高H型血管數(shù)量以上調(diào)骨密度[5]。本研究結(jié)果顯示，去卵巢大鼠骨密度和血管生成情況降低，組織Slit3 mRNA表達(dá)水平略升高和蛋白表達(dá)水平顯著升高；其可能原因是Slit3與H型血管密切相關(guān)，PMOP為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞均過度活躍，導(dǎo)致其Slit3表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)合文獻(xiàn)報道均表明Slit3是調(diào)控成血管-成骨偶聯(lián)的關(guān)鍵因子之一，可能成為POMP診斷和治療的新靶點(diǎn)，進(jìn)一步探討其上游潛在的miRNA調(diào)控機(jī)制勢在必行。

miRNAs是內(nèi)源基因編碼的19-24nt非編碼單鏈RNA，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA經(jīng)剪切后成miRNA前體pre-miRNA，再轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿經(jīng)Dicer酶切成成熟miRNA，與靶基因3′UTR堿基配對結(jié)合，依賴RISC降低靶基因穩(wěn)定性引導(dǎo)降解或抑制表達(dá)，在PMOP病程中起重要調(diào)控作用。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠外泌體中miR-214-3p表達(dá)水平增高，過表達(dá)miR-214-3p出現(xiàn)H型血管新生減少和小管形成數(shù)量降低。Lin等[16]發(fā)現(xiàn)miR-338靶向Runx2/Sox4/調(diào)控成骨細(xì)胞分化，PMOP患者和OVX小鼠血清中miR-338表達(dá)水平均顯著增高，并且注射miR-338抑制劑可顯著預(yù)防卵巢切除導(dǎo)致的快速骨丟失。近年來miR-148b-5p的生物學(xué)功能研究逐漸增加，miR-148b-5p可通過靶向負(fù)調(diào)控CALR表達(dá)以調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞的增殖和遷移，可能是周圍神經(jīng)損傷治療的新靶點(diǎn)[17]；胃癌(gastric cancer，GC)患者miR-148b-5p表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-148b-5p在體內(nèi)外均可顯著抑制GC細(xì)胞增殖和侵襲，靶向ATPIF1直接抑制免疫微環(huán)境和胃癌進(jìn)展[18]。

本研究結(jié)果顯示，miR-148b-5p通過靶向結(jié)合Slit3-3'UTR調(diào)控H型血管關(guān)鍵調(diào)控因子Slit3表達(dá)，可能參與成血管-成骨偶聯(lián)的調(diào)控，可能是PMOP發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制之一。綜上所述，本研究初步探討miR-148b-5p和Slit3的作用機(jī)制，后續(xù)將進(jìn)一步研究PMOP中miR-148b-5p的差異表達(dá)，并通過gain-of-function和loss-of-function觀察其調(diào)控H型血管表型的變化，以成血管-成骨偶聯(lián)切入點(diǎn)深入闡釋PMOP的病理機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供新思路和方向。