白木香2種外植體的組織培養(yǎng)

張 燕，孟 慧，呂菲菲，魏建和，樊小紅，何 欣，袁白雪，陳 波，楊 云*

白木香2種外植體的組織培養(yǎng)

張 燕1,2，孟 慧1,2，呂菲菲1，魏建和1,2，樊小紅1，何 欣1,2，袁白雪1，陳 波1，楊 云1,2*

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所/海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南?？?570311；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

沉香是國(guó)際上極負(fù)盛名的藥用和香料資源之一。在亞洲許多國(guó)家，沉香產(chǎn)業(yè)既是傳統(tǒng)行業(yè)也是發(fā)展迅猛的新興產(chǎn)業(yè)。沉香優(yōu)良種質(zhì)的大規(guī)模應(yīng)用對(duì)沉香產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。因此優(yōu)良沉香種質(zhì)資源是近年沉香產(chǎn)業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，但一些優(yōu)良種質(zhì)的品質(zhì)特性無(wú)法通過(guò)有性繁殖遺傳，大規(guī)模繁育存在技術(shù)障礙。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在品種優(yōu)良性狀保持、種子資源保存、快速繁殖等方面具有非常突出的優(yōu)越性，被廣泛應(yīng)用于中藥資源保護(hù)和中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為建立工業(yè)化生產(chǎn)的沉香廣譜再生體系，本文以白木香無(wú)菌苗和成齡植株的枝條為材料從外植體消毒、叢生芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)三方面進(jìn)行組織培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，通過(guò)0.1%多菌靈溶液浸泡3 min，流動(dòng)水沖洗3 h處理，對(duì)采摘自大田的白木香枝條有較好的除菌效果。0.1%升汞溶液消毒6～8 min，可有效保持外植體的成活率。在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加滅菌劑也能有效控制材料染菌。無(wú)菌苗莖段叢生芽誘導(dǎo)較易，大田枝條的叢生芽誘導(dǎo)較難。WPM + 20 g/L蔗糖+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA (G4)有利于無(wú)菌苗的叢生芽誘導(dǎo)；1/2 MS+25 g蔗糖+2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA (I3)，1/4 MS+20 g/L蔗糖+ 2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA (J2)和WPM+20 g蔗糖+1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA (K2)有利于成齡植株枝條外植體的叢生芽誘導(dǎo)，將膨大的叢生芽團(tuán)切割后轉(zhuǎn)接于不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中可促進(jìn)叢生芽伸長(zhǎng)。WPM培養(yǎng)基中添加10～20 g/L蔗糖，并加入0.1～0.5 mg/L NAA可誘導(dǎo)無(wú)菌苗和莖段外植體的新芽生根。本研究以沉香2種外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，成功獲得再生植株，為沉香優(yōu)良種質(zhì)的無(wú)性繁殖提供技術(shù)參考。

白木香；組織培養(yǎng)；外植體消毒；叢生芽誘導(dǎo)；生根培養(yǎng)

沉香是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（）植物受傷后形成的含樹(shù)脂的木材，是傳統(tǒng)名貴中藥和重要香料，有“藥中黃金，香中之王”之美稱[1]?！侗静菥V目》中記載“海南沉香，一片萬(wàn)錢”，并依沉水程度將沉香分為沉水香、棧香和黃熟香三級(jí)[2]。奇楠沉香作為沉香中的珍品，不僅香味襲人，更是藥物中的珍寶[3]。沉香作為藥用具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效，自古以來(lái)醫(yī)家都選用上等沉香入藥。沉香作為香料在日本、中東、歐美等國(guó)家和地區(qū)也被廣泛應(yīng)用于香道、宗教用香和香水產(chǎn)業(yè)等[4]。沉香野生資源由于品質(zhì)良好深受人們追捧，但多年來(lái)遭到過(guò)度開(kāi)發(fā)，資源瀕臨滅絕[5]。天然沉香的稀缺導(dǎo)致沉香價(jià)格居高不下，品質(zhì)較好的沉香市場(chǎng)價(jià)格高到萬(wàn)元每克[6]。

白木香[(Lour.) Gilg]是國(guó)產(chǎn)中藥沉香的基原物種[7-8]。為了解決沉香資源少，優(yōu)質(zhì)沉香資源匱乏的問(wèn)題，我國(guó)沉香主產(chǎn)區(qū)廣東、海南、云南、廣西和福建等地大面積種植白木香樹(shù)[9]，同時(shí)開(kāi)展結(jié)香技術(shù)研究[10-12]。魏建和團(tuán)隊(duì)創(chuàng)造發(fā)明的通體結(jié)香技術(shù)具有“三高一穩(wěn)定”的特點(diǎn)[13]，解決了沉香產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中的結(jié)香技術(shù)瓶頸問(wèn)題，為沉香市場(chǎng)提供了大量的沉香藥材，基本解決了沉香資源的供應(yīng)問(wèn)題。但面臨市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)沉香的需求量持續(xù)上漲，優(yōu)質(zhì)沉香的價(jià)格仍然高企。

沉香優(yōu)良結(jié)香種質(zhì)是決定沉香品質(zhì)的重要因素之一，優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的選育和應(yīng)用是沉香高質(zhì)量發(fā)展的有效途徑。近年來(lái)，許多研究者和種植農(nóng)戶在沉香優(yōu)良種質(zhì)資源的選育和繁殖做了大量工作，在研究和實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)有性繁殖存在種子存活時(shí)間短、種子（種苗）來(lái)源不清、后代性狀分離的問(wèn)題[14-17]。歷史上有“有奇楠香，沒(méi)有奇楠樹(shù)”的說(shuō)法，即野生高品質(zhì)白木香樹(shù)實(shí)生苗未能遺傳母本結(jié)香優(yōu)良性狀[2]，而將母樹(shù)枝條嫁接至白木香可結(jié)出高品質(zhì)沉香[18]。因此，無(wú)性繁殖方式是沉香優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的最佳繁育方式?，F(xiàn)有的無(wú)性繁殖方式有扦插、嫁接、高空壓條、組培等[19-20]，已證實(shí)沉香屬植物扦插成活率很低[21]；高空壓條繁育速度慢，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)[22]；實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)嫁接雖然在沉香優(yōu)質(zhì)種苗方面有大規(guī)模應(yīng)用，但也存在種質(zhì)混雜、代數(shù)退化及成活率不高等問(wèn)題，在一定程度上也造成了白木香砧木的浪費(fèi)。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展依據(jù)植物細(xì)胞的全能性理論和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用，組織培養(yǎng)具有繁殖速度快、周期短、環(huán)境條件可控和經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，在品種優(yōu)良性狀保持、種質(zhì)資源保存、快速繁殖方面等具有非常突出的優(yōu)越性[23]，廣泛應(yīng)用于中藥資源保護(hù)和中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展[24]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖白木香優(yōu)良種質(zhì)，對(duì)沉香產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和白木香野生資源的保護(hù)有十分重要的意義。前人對(duì)白木香組織培養(yǎng)繁殖方式研究取得一定的進(jìn)展，但大部分研究者選擇采用苗圃或溫室栽培的幼嫩小苗或種子培養(yǎng)的無(wú)菌苗作為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)[25-28]，所建立的再生體系不具有廣譜性，且無(wú)法保證再生植株為結(jié)香優(yōu)良種質(zhì)。以成齡植株枝條為外植體能夠保證優(yōu)良種質(zhì)遺傳的穩(wěn)定性，但以自然生長(zhǎng)環(huán)境下的植株為材料受生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)季節(jié)、光照、水分等因素影響，材料消毒和培養(yǎng)難度較大。植物組織培養(yǎng)中，污染主要來(lái)自外植體，除了表面的污染外，內(nèi)生菌也普遍存在于植物組織中，難以采用常規(guī)方法徹底消滅[29]。大量研究表明，白木香植株體內(nèi)攜帶一定數(shù)量的內(nèi)生真菌和細(xì)菌[30]，對(duì)白木香的組織培養(yǎng)消毒影響重大。其次，木本植物增殖、生根困難也是阻礙組培苗產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，本研究針對(duì)外植體消毒、叢生芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)進(jìn)行了研究，旨在為白木香優(yōu)良種質(zhì)的育種工作和沉香優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的材料均來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所海口研發(fā)中心試驗(yàn)田種植的3年生白木香樹(shù)。分別以其種子培養(yǎng)的無(wú)菌苗和當(dāng)年萌發(fā)枝條為外植體。

1.2 方法

1.2.1 成齡植株枝條外植體消毒方式研究 ①外植體前處理方式研究：將采摘自大田的枝條做不同前處理。枝條基部老莖和葉片剪除后分為含有2～3個(gè)腋芽的小段。采用50%的多菌靈（0.1 g/L）分別處理3、5、10 min（分別對(duì)應(yīng)處理A1、A2、A3），流動(dòng)水沖洗30 min；采用多菌靈溶液浸泡3 min，流動(dòng)水分別處理1、2、3 h（分別對(duì)應(yīng)處理B1、B2、B3）。前處理完成后將外植體轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗1次。0.1%升汞溶液浸泡8 min，無(wú)菌水沖洗5次。將外植體取出置于濾紙上吸干水分，切除與消毒劑接觸部分后，接種于WPM培養(yǎng)基中，每種前處理方式接種15個(gè)外植體，重復(fù)3次，7 d后統(tǒng)計(jì)接種外植體的染菌數(shù)量和存活數(shù)量，分別計(jì)算染菌株數(shù)和存活株數(shù)占總接種外植體數(shù)量的比例，取3次重復(fù)的平均值作為3種前處理方式的染菌率和存活率。

②外植體消毒方式研究：修剪好的枝條外植體在洗潔精水溶液中浸泡攪拌15 min，多菌靈溶液浸泡3 min，流動(dòng)自來(lái)水沖洗30 min，完成預(yù)處理后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)。75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗1次，分別做單一升汞（HgCl2）溶液不同時(shí)長(zhǎng)處理和升汞（HgCl2）溶液配合過(guò)氧化氫（H2O2）溶液不同時(shí)長(zhǎng)處理。0.1%升汞溶液處理時(shí)長(zhǎng)分別為6、8、10 min（分別對(duì)應(yīng)處理C1、C2、C3）；10%過(guò)氧化氫溶液處理時(shí)長(zhǎng)分別為2、5、10 min（分別與0.1%升汞溶液處理5 min配合使用，對(duì)應(yīng)處理D1、D2、D3）。消毒液處理后，無(wú)菌水沖洗5次。將外植體取出置于濾紙上吸干水分，切除與消毒劑接觸部分后，接種于WPM培養(yǎng)基中，每種消毒方式接種15個(gè)外植體，重復(fù)3次，7 d后統(tǒng)計(jì)接種外植體的染菌數(shù)量和存活數(shù)量，分別計(jì)算染菌株數(shù)和存活株數(shù)占總接種外植體數(shù)量的比例，取3次重復(fù)的平均值作為3種外植體消毒方式的染菌率和存活率。

③滅菌藥劑篩選：枝條外植體在洗潔精水溶液中浸泡攪拌15 min，多菌靈溶液浸泡3 min，流動(dòng)自來(lái)水沖洗30 min；在超凈工作臺(tái)中使用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗1次，0.1%升汞溶液處理8 min，無(wú)菌水沖洗5次；將外植體取出置于濾紙上吸干水分，切除與消毒劑接觸部分后，接種于添加滅菌藥劑的WPM培養(yǎng)基中，添加卡松處理濃度為：100 μL/L、1 mL/L、5 mL/L（分別對(duì)應(yīng)處理E1、E2、E3）；添加植菌清處理濃度為：2、2.5、3 mL/L（分別對(duì)應(yīng)處理F1、F2、F3）。每種消毒方式接種15個(gè)外植體，重復(fù)3次，7 d后統(tǒng)計(jì)接種外植體的染菌數(shù)量和存活數(shù)量，分別計(jì)算染菌株數(shù)和存活株數(shù)占總接種外植體數(shù)量的比例，取3次重復(fù)的平均值作為使用滅菌藥劑處理方式的染菌率和存活率。

1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)研究 ①無(wú)菌苗叢生芽誘導(dǎo)：以種子培養(yǎng)的無(wú)菌苗為材料，截取莖段，接種于不同培養(yǎng)基中（表1），溫度為(25±2)℃，濕度為60%，光照/黑暗時(shí)間為13 h/11 h的條件下培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種30個(gè)無(wú)菌苗莖段，50 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的數(shù)量和生長(zhǎng)叢生芽莖段的株數(shù)，計(jì)算新萌發(fā)叢生芽的數(shù)量與生長(zhǎng)叢生芽的莖段數(shù)比例作為叢生芽誘導(dǎo)率。

表1 無(wú)菌苗莖段叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

②成齡植株枝條叢生芽誘導(dǎo)：以大田采集的成齡植株幼嫩枝條為材料，滅菌消毒后修剪為含有2～3個(gè)腋芽的小段，接種于不同培養(yǎng)基中（表2），溫度為(25±2)℃，濕度為60%，光照/黑暗時(shí)間為13 h/11 h的條件下，培養(yǎng)基接種30個(gè)無(wú)枝條莖段，50 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的數(shù)量和生長(zhǎng)叢生芽外植體株數(shù)，計(jì)算新萌發(fā)叢生芽的數(shù)量與生長(zhǎng)叢生芽的外植體數(shù)量比例作為叢生芽誘導(dǎo)率。

表2 枝條莖段外植體叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.2.3 生根誘導(dǎo) 分別以無(wú)菌苗的莖段和枝條誘導(dǎo)的叢生芽為材料，接種于不同生根培養(yǎng)基中（表3），培養(yǎng)條件：溫度為(25±2)℃，濕度為60%，光照/黑暗時(shí)間為13 h/11 h。45 d后統(tǒng)計(jì)存活株數(shù)和生根株數(shù)，計(jì)算生根植株的數(shù)量與存活的材料數(shù)量比例為生根率。

表3 生根培養(yǎng)基

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段外植體消毒方式研究

①莖段外植體前處理方式。采用多菌靈溶液浸泡和流動(dòng)水沖洗2種前處理方式對(duì)白木香莖段外植體進(jìn)行滅菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1。延長(zhǎng)流動(dòng)水沖洗時(shí)間的前處理方式下外植體染菌率總體低于延長(zhǎng)多菌靈溶液浸泡時(shí)間的前處理方式，且存活率高于多菌靈溶液浸泡的前處理方式。隨著多菌靈溶液浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，外植體的存活率下降，采用多菌靈浸泡處理3 min，外植體存活率為57.78%。而隨著流動(dòng)水沖洗時(shí)間延長(zhǎng)，外植體的染菌率明顯下降，流動(dòng)水沖洗3 h時(shí)，存活率達(dá)到73.77%，染菌率下降到6.67%。

圖1 不同消毒前處理方式對(duì)莖段外植體的滅菌效果

②莖段外植體消毒方式。以過(guò)氧化氫（H2O2）溶液配合升汞（HgCl2）溶液處理方式和單獨(dú)使用HgCl2溶液方式分別對(duì)白木香莖段外植體進(jìn)行消毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2。延長(zhǎng)HgCl2溶液浸泡時(shí)間的消毒方式外植體染菌率顯著低于延長(zhǎng)H2O2溶液浸泡時(shí)間的處理方式，且存活率遠(yuǎn)高于延長(zhǎng)H2O2溶液浸泡時(shí)間的處理方式。H2O2+HgCl2處理方式下，外植體存活率極低，將H2O2浸泡的時(shí)長(zhǎng)增加至10 min，其外植體的存活率僅有20%。而單獨(dú)使用HgCl2溶液處理后，外植體的存活率高達(dá)83.33%，染菌率最低僅為13.33%。

圖2 不同消毒方式對(duì)莖段外植體的滅菌效果

③滅菌劑最佳利用方式。在培養(yǎng)基中添加卡松和植菌素2種抑菌劑的處理方式對(duì)白木香莖段外植體進(jìn)行滅菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3。在培養(yǎng)基中添加2種抑菌劑均能獲得較高的外植體存活率和較低的染菌率?？ㄋ商砑恿繛? mL/L時(shí)，外植體的存活率達(dá)到73.33%，植菌素添加量為2～2.5 mL/L時(shí)，存活率高達(dá)76.67%，染菌率降低至6.67%。

2.2 叢生芽誘導(dǎo)

①無(wú)菌苗叢生芽誘導(dǎo)。無(wú)菌苗莖段為材料誘導(dǎo)叢芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4和圖4。添加6-BA和NAA兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)叢芽。添加TDZ和NAA的WPM培養(yǎng)基中愈傷組織生長(zhǎng)較好，而叢芽誘導(dǎo)效果較差。G1～G4培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)叢芽，G3培養(yǎng)基中的增殖率最高，增殖倍數(shù)達(dá)到6倍，但增殖芽的葉片細(xì)短；而G4培養(yǎng)基中增殖率較高，增殖倍數(shù)為5.5，葉片大且舒展，植株生長(zhǎng)健壯，G1培養(yǎng)基中次之。G5～G8培養(yǎng)基中外植體產(chǎn)生大塊愈傷組織，誘導(dǎo)的叢生芽難以伸長(zhǎng)。

圖3 添加不同抑菌劑對(duì)莖段外植體的滅菌效果

圖4 無(wú)菌苗莖段誘導(dǎo)叢芽過(guò)程

表4 無(wú)菌苗叢生芽誘導(dǎo)效果

注：增殖倍數(shù)=從芽總數(shù)/生長(zhǎng)叢芽總株數(shù)。

Note: Proliferation multiple=The total number of multiple buds/ The total number of plants with multiple buds.

②成齡植株枝條叢生芽誘導(dǎo)。成齡植株枝條的莖段為外植體叢生芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5和圖5，在1/2 MS培養(yǎng)基、1/4 MS培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基中莖段外植體均可存活，而在MS培養(yǎng)基中，外植體出現(xiàn)黃化、萎蔫、枯死的情況。在I3、J2、K2培養(yǎng)基配方中叢生芽生長(zhǎng)良好，在I2、J3、K4培養(yǎng)基配方中能誘導(dǎo)腋芽伸長(zhǎng)、在K3培養(yǎng)基配方中莖段基部產(chǎn)生愈傷組織。將莖段獲得叢芽團(tuán)塊整體切下后轉(zhuǎn)接至不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中，不定芽伸長(zhǎng)，植株健壯，可用于繼續(xù)增殖或生根培養(yǎng)。

表5 莖段外植體叢生芽誘導(dǎo)效果

圖5 成齡植株枝條叢生芽誘導(dǎo)過(guò)程

2.3 生根誘導(dǎo)

無(wú)菌苗莖段生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6和圖6。L1～L3培養(yǎng)基中均可生根，且培養(yǎng)至30 d時(shí)，3個(gè)培養(yǎng)基中均有根萌發(fā)。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)生根結(jié)果如表6，在L1～L3培養(yǎng)基中，生根率分別達(dá)到66.67%、76.47%、70.59%，而在L4培養(yǎng)基中無(wú)新根產(chǎn)生。

表6 無(wú)菌苗生根效果

圖6 無(wú)菌苗莖段生根過(guò)程

將成齡植株枝條莖段誘導(dǎo)的叢生芽分離單枝，在L1～L3培養(yǎng)基中也獲得根，但生根數(shù)量較少，生根所需時(shí)間長(zhǎng)（圖7）。

圖7 成齡植株枝條生根過(guò)程

3 討論

3.1 外植體的選擇和滅菌

外植體選擇在一定程度上決定植株再生途徑，且生長(zhǎng)環(huán)境能對(duì)其消毒難易程度產(chǎn)生影響。通常情況下生長(zhǎng)在自然環(huán)境或大田的成齡植株容易在外部和內(nèi)部感染微生物，且木本植物會(huì)隨著植物年齡的增加，再生能力下降，因此不作為組織培養(yǎng)的首選外植體材料[23]。而面臨物種瀕危、種質(zhì)頑拗性及種子繁育后代性狀分離的情況下[31]，生長(zhǎng)在室外的成齡植株作為組織培養(yǎng)外植體可發(fā)揮其數(shù)量多、采摘便利、不影響植株整體生長(zhǎng)、最大程度上保持物種的遺傳穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)。但目前在沉香屬植物組織培養(yǎng)中，由于種子或室內(nèi)小苗為材料有培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單，成活率高的特點(diǎn)，因此被許多研究者用作首選材料[32-33]。沉香屬組織培養(yǎng)一般采用常規(guī)兩步消毒方式處理獲得無(wú)菌外植體材料，即先用洗潔精溶液浸泡和清水流動(dòng)沖洗0.5～1 h，除去表面污垢，其次在超凈工作臺(tái)中用70%～75%的乙醇浸泡30 s、0.1%～0.2%升汞溶液處理5～10 min，以消除外植體表面微生物等[33-34]。但在組織培養(yǎng)研究選擇大田植株為材料時(shí)需要進(jìn)行嚴(yán)格的前處理[32]。本研究中發(fā)現(xiàn)，成齡植株枝條外植體經(jīng)多菌靈溶液浸泡3 min，流動(dòng)水沖洗3 h，0.1%升汞（HgCl2）溶液消毒6～8 min，才能有效提高外植體的存活率。在培養(yǎng)基中添加1 mL/L卡松或2～3 mL/L植菌清也可有效降低大田的枝條外植體的染菌率。

通過(guò)外植體消毒研究得出適當(dāng)?shù)南痉绞侥苡行У慕档屯庵搀w的染菌率，多種消毒方式的綜合利用能有效提高外植體的存活率。生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植株，受環(huán)境條件影響，且容易受到病蟲(chóng)害侵襲。成年白木香植株枝條嫩莖采用適當(dāng)?shù)那疤幚砗拖痉绞侥軌蛴行С?/p>

3.2 叢生芽和生根誘導(dǎo)

腋芽從生法以其操作簡(jiǎn)便，繁殖速度快，可保持遺傳穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)廣泛用于園藝、農(nóng)林果樹(shù)等林木植物的組培繁殖。高等植物的每一個(gè)葉片的葉腋部位都有一個(gè)或幾個(gè)腋芽，以帶芽的莖段作為外植體材料，通過(guò)促進(jìn)腋芽最大限度生長(zhǎng)，產(chǎn)生的多芽為叢生芽[32]。叢生芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)主要受植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)控，添加細(xì)胞分裂素可促進(jìn)叢生芽產(chǎn)生，添加植物生長(zhǎng)素和赤霉素可誘導(dǎo)莖軸伸長(zhǎng)[35]。有研究表示，在沉香屬植物組織培養(yǎng)中，添加較高濃度的細(xì)胞分類素和較低的生長(zhǎng)素有利于芽的分化[36-39]。本研究結(jié)果顯示，無(wú)菌苗誘導(dǎo)叢生芽對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的要求較低，添加0.5～1.5 mL/L的6-BA和0.1～0.2 mL/L的NAA，均可獲得叢生芽；以枝條為材料的叢生芽誘導(dǎo)較復(fù)雜，在培養(yǎng)基中添加1～2 mL/L的6-BA和0.01～0.5 mL/L的NAA有利于叢生芽的誘導(dǎo)，將叢生芽轉(zhuǎn)移至不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中有利于芽生長(zhǎng)。針對(duì)沉香屬植物組織培養(yǎng)生根困難問(wèn)題，許多研究者采用兩步生根法在1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，并成功生根[39-41]。也有研究者通過(guò)直接生根法獲得再生植株，在空白WPM培養(yǎng)基中添加NAA/IBA（0.3～0.5 mL/L），生根率可達(dá)到65%[40]。本研究結(jié)果顯示，在WPM培養(yǎng)基中添加0.1～0.5 mL/L NAA，可誘導(dǎo)無(wú)菌苗和枝條誘導(dǎo)的叢生芽生根；但成齡植株枝條的芽生根數(shù)量較少，生根所需時(shí)間長(zhǎng)。這可能與材料的復(fù)幼程度有關(guān)，幼嫩材料與成年階段的材料相比，生根能力較高。

通過(guò)叢生芽誘導(dǎo)研究得出針對(duì)不同的外植體材料選擇合適的培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芽的誘導(dǎo)至關(guān)重要。無(wú)菌苗為材料誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)較易，成齡植株的枝條誘導(dǎo)叢生芽較困難，且在生根誘導(dǎo)中成齡植株枝條所獲得的叢生芽生根也較困難，這可能與材料的復(fù)幼程度有關(guān)，幼嫩材料與成年階段的材料相比，分化能力較高。

4 結(jié)論

沉香屬植物是全球?yàn)l危物種中貿(mào)易量最多的物種之一，也是全球最具有商業(yè)價(jià)值的植物物種之一[41]。面臨沉香野生資源破壞嚴(yán)重，栽培種質(zhì)參差不齊的現(xiàn)狀，良種選育和苗木培育工作勢(shì)在必行。離體組培技術(shù)繁殖速度快、效率高，對(duì)滿足市場(chǎng)需求、提高沉香產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益有重要意義，利用組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的無(wú)性系遺傳特性一致，對(duì)沉香屬植物優(yōu)良種質(zhì)選育和野生資源保護(hù)具有特殊作用[32]。白木香組織培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的探索和研究獲得了一定的成果，種子無(wú)菌苗再生植株技術(shù)已趨于成熟，但在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)白木香種子存在性狀分離情況，因此以種苗作為組培材料并不能完全保證再生的植株為優(yōu)良種質(zhì)量，需要在結(jié)香完成后才能辨別。而直接以成齡植株枝條為外植體能夠最大程度上保證優(yōu)良種質(zhì)，且外植體材料充足。但以自然生長(zhǎng)環(huán)境下的植株為材料受生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)季節(jié)、光照、水分等因素影響，材料消毒和培養(yǎng)難度較大，所建立的再生體系還不能滿足大規(guī)模種苗生產(chǎn)，因此還需要進(jìn)一步完善。建立穩(wěn)定的白木香植株再生體系，可解決白木香優(yōu)良種苗的供應(yīng)問(wèn)題，將會(huì)成為白木香種質(zhì)資源保護(hù)及生產(chǎn)的有效途徑，并有望解決目前沉香產(chǎn)業(yè)發(fā)展中優(yōu)質(zhì)沉香資源缺乏的問(wèn)題。

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Tissue Culture with Two Different Organs of

ZHANG Yan1,2, MENG Hui1,2, LYU Feifei1, WEI Jianhe1,2, FAN Xiaohong1, HE Xin1,2, YUAN Baixue1, CHEN Bo1, YANG Yun1,2*

1. Hainan Branch Institute of Medicinal Plant, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College / Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine / Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization, Haikou, Hainan 570311, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College / Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education / National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Beijing 100193, China

Agarwood,(Lour.) Gilg, is one of the most famous medicinal and spice resources in the world. In many Asian countries, the agarwood industry is both a traditional and rapidly developing emerging industry. As we all know, the large-scale application of high-quality agarwood germplasm resources is of great significance for the sustainable development of the agarwood industry. Therefore, high quality agarwood germplasm resources have been the focus and hotspot of the agarwood industry in recent years. However, the characteristics of some high quality germplasm cannot be inherited through sexual reproduction, and the technical barriers for large-scale breeding exist in now. Tissue culture has outstanding advantages in aspects of maintaining excellent traits of varieties, preservation of seed resources, and rapid propagation, which is widely used in Chinese medicine resources conservation and traditional Chinese medicine industry development. In order to establish a broad-spectrum agarwood regeneration system for industrial production, aseptic seedlings and mature plant branches were used to plant regeneration techniques research from explant disinfection, cluster bud induction and rooting culture in this study. The results showed that the tender stems picked in the field were effectively sterilized by soaked in 0.1% carbendazim solution for 3 min and rinsed with flowing water for 3 h. The survival rate of explants could be maintained by disinfecting with 0.1% mercury liter solution for 6～8 min. In addition, appropriate addition of sterilizer into the culture medium could also control material contamination effectively.The stems of aseptic seedlings were easier to induce new buds, while the stems of branch were more difficult to induce secondary shoots as explants. The multiple shoots of aseptic seedlings could induced in WPM medium supplemented with 0.5 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L NAA and 20 g/L sucrose (G4). The three advisable multiplication media for branches were 1/2 MS + 25 g/L sucrose + 2 mg/L 6-BA + 0.01 mg/L NAA (I3), 1/4 MS+20 g/L sucrose + 2 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA (J2) and WPM + 20 g/L sucrose + 1 mg/L 6-BA + 0.01 mg/L NAA (K2). Then the enlarged clump bud clusters were cut and transferred to WPM medium without plant growth additives which helped grow buds to become rootless shoots.New shoots could be induced to root in the WPM medium with adding 20–30 g/L sucrose 0.1–0.2 mg/L NAA. In this paper, two explants of agarwood were used for tissue culture and successfully obtained regenerated plants, which provided a technical reference for the asexual reproduction of high-quality agarwood germplasm.

(Lour.) Gilg;culture; explant disinfection; multiple bud induction; rooting culture

S567.19

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.07.018

2021-08-09；

2022-01-05

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2018YFC1706401）。

張 燕（1993—），女，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源可持續(xù)利用。*通信作者（Corresponding author）：楊 云（YANG Yun），E-mail：yangyun43@aliyun.com。