綿羊體外胚胎高效利用的研究

陳 瑩，魯鳳霞，田文麗，仇春娟，梅 榮，范利宏，陳大勇，吳陽(yáng)升，林嘉鵬，黃俊成，劉明軍，汪立芹

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.內(nèi)蒙古四子王旗烏蘭花鎮(zhèn)人民政府，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 011800；3.內(nèi)蒙古四子王旗腦木更蘇木人民政府，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 011800；4.內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 011800；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食家畜遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；6.新疆動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011)

【研究意義】超數(shù)排卵及胚胎移植(MOET)技術(shù)，是以生產(chǎn)體內(nèi)囊胚或桑椹胚，移植至同期發(fā)情的受體內(nèi)獲得后代的技術(shù)。因能加快供體的繁殖效率，在牛、綿羊、山羊等家畜的良種擴(kuò)繁中應(yīng)用廣泛。但該技術(shù)應(yīng)用于綿羊，需要通過手術(shù)方式回收胚胎，對(duì)供體造成損傷較大。多次處理易使供體卵巢、子宮、輸卵管等相互粘連，而無法繼續(xù)繁殖，此時(shí)的供體大部分仍處于青壯年時(shí)期，淘汰尤為可惜。體外胚胎生產(chǎn)(In vitro embryo production, IVP)技術(shù)，可充分利用這些供體卵巢上卵泡能正常發(fā)育的特點(diǎn)進(jìn)行體外胚胎生產(chǎn)。通過外源激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，采集卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，對(duì)其進(jìn)行體外成熟(In vitro maturity, IVM)、體外受精(In vitro fertilization, IVF)和體外培養(yǎng)(In vitro embryo culture, IVC)，從而獲得不同發(fā)育時(shí)期的胚胎。該項(xiàng)研究不僅有助于了解哺乳動(dòng)物早期胚胎的發(fā)育機(jī)制，還可用于保存較高遺傳價(jià)值的動(dòng)物種質(zhì)資源；再加上微創(chuàng)采卵技術(shù)的研發(fā)，將大大加快良種家畜的繁殖速度和遺傳改良進(jìn)程[1]。目前，IVP技術(shù)在良種羊上的應(yīng)用率仍然較低，主要與體外胚胎發(fā)育率不穩(wěn)定、利用率不高等因素有關(guān)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】充分了解胚胎質(zhì)量并合理制定移植計(jì)劃是胚胎高效利用的關(guān)鍵。受精卵裂時(shí)間作為無創(chuàng)性的胚胎質(zhì)量預(yù)測(cè)指標(biāo)，可用于移植前胚胎的選擇和評(píng)估。卵裂快慢對(duì)于胚胎的發(fā)育潛能及移植后妊娠結(jié)局具有重要影響。在人[2-3]和小鼠[4]、牛[5]、馬[6]、豬[7]、貓[8]等動(dòng)物中均有研究。通過對(duì)綿羊體外胚胎延時(shí)攝影的最新研究發(fā)現(xiàn)，卵裂較快胚胎具有較高的囊胚率[9]，但還不清楚不同卵裂速度的胚胎對(duì)懷孕率的影響。通常認(rèn)為體外胚胎的質(zhì)量相對(duì)較差，本團(tuán)隊(duì)移植綿羊早期體外胚胎時(shí)，發(fā)現(xiàn)移植2枚體外胚胎才具有類似于單枚體內(nèi)胚胎的懷孕率[10]。在體外胚胎移植時(shí)，理論上被移植的胚胎越早進(jìn)入體內(nèi)環(huán)境，更有利于著床和發(fā)育。但鐵新琴等[11]在人的IVF-ET研究中指出，囊胚期胚胎移植可明顯提高胚胎植入率及妊娠率。而曾梅芳[12]研究指出卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇移植與囊胚期胚胎冷凍復(fù)蘇移植二者妊娠結(jié)局沒有差異，說明發(fā)育時(shí)期對(duì)妊娠結(jié)局的影響不是一定的，除人以外的其他哺乳動(dòng)物中有關(guān)體外胚胎發(fā)育時(shí)期對(duì)移植后懷孕率影響的研究較少。移植胚胎數(shù)也是影響受體懷孕率的因素之一，受體母牛移植2枚鮮胚(B級(jí)胚胎)的妊娠率與移植切割后新鮮雙半胚和單枚鮮胚的妊娠率相比，差異雖不顯著(P>0.05)，但移植2枚鮮胚(B級(jí)胚胎)的效果最好[13]。另外，鐵新琴等也指出人類囊胚移植時(shí)雙胚移植為最好選擇。【本研究切入點(diǎn)】為充分挖掘良種肉羊的繁殖潛能，本研究從淘汰杜泊母羊卵巢獲取卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體，結(jié)合IVP技術(shù)，分析卵裂快慢的早期胚胎和囊胚對(duì)移植懷孕率的影響，從而提高體外胚胎利用率，以期每只供體獲得更多的后代?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過探究綿羊體外胚胎卵裂快慢與其發(fā)育潛能的關(guān)系以及對(duì)受胎的影響，為綿羊體外胚胎高效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體母羊?yàn)閬碜詢?nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司(內(nèi)蒙古)，健康狀況良好、體格健碩、繁殖性能優(yōu)秀但因多次超排導(dǎo)致沖胚困難的杜泊羊。受體羊?yàn)閬碜詢?nèi)蒙古四子王旗烏蘭花鎮(zhèn)和腦木更蘇木的蒙古羊。杜泊細(xì)管凍精購(gòu)自ALLSTOCK(WA)公司(澳大利亞)。卵泡刺激素(FSH)、孕馬血清促性腺激素(PMSG)等均購(gòu)自寧波三生藥業(yè)有限公司(寧波)；海綿栓購(gòu)自新西蘭輝瑞公司。體外胚胎生產(chǎn)使用的IVM、IVF及IVC培養(yǎng)液均為博瑞鼎?體外胚胎培養(yǎng)系列產(chǎn)品(新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊)。Triton X-100、抗熒光淬滅劑購(gòu)自北京索來寶公司；DAPI染液購(gòu)自 Genview公司。其它生化試劑除特別注明外均為國(guó)藥集團(tuán)分析純產(chǎn)品。

1.2 體外胚胎生產(chǎn)

1.2.1 供體處理及活體采卵 因多次超數(shù)排卵—胚胎移植(MOET)等原因?qū)е螺斅压?、子宮角、腹膜相互粘連而無法繼續(xù)使用的純種杜泊母羊作為供體，激素處理方法同文獻(xiàn)[14]。簡(jiǎn)單地講，在其陰道內(nèi)放置海綿栓進(jìn)行同期發(fā)情處理，埋栓第9天供體開始注射FSH，分6次注射，每次間隔12 h，總劑量為 240 IU。第6針結(jié)束后12～13 h 進(jìn)行活體采卵(采卵后撤去海綿栓)或屠宰采卵?；铙w采卵手術(shù)前供體羊禁水禁食24 h。

1.2.2 卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和胚胎體外培養(yǎng) 回收的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，經(jīng)抽卵液和成熟液逐步洗滌后，按50～80枚/孔置于內(nèi)含600 μL IVM培養(yǎng)液孔中，于5%CO2、38.6 ℃、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行成熟培養(yǎng)22 h。將體外成熟COCs移至0.1%的透明質(zhì)酸酶液滴中，輕輕吹吸去除卵母細(xì)胞外圍擴(kuò)展的大塊卵丘細(xì)胞，按50～70枚/孔置于內(nèi)含500 μL IVF液孔中。凍精經(jīng)解凍復(fù)蘇，上游獲能，取上層精子與成熟后的卵母細(xì)胞共孵育，培養(yǎng)條件與體外成熟相同。

分別在體外受精后的24、36、48 h 觀察胚胎卵裂情況，將卵裂胚胎挑出分組培養(yǎng)。受精24 h(24 hour post insemination，24 hpi)觀察時(shí)卵裂的胚胎記作卵裂快組，受精36和48 h觀察新增加的卵裂胚胎統(tǒng)稱為卵裂慢組(36 和48 hpi組)，舍棄48 hpi還未卵裂的卵母細(xì)胞。不同組的胚胎分別置于新的平衡好的IVC液中，發(fā)育至第7天時(shí)統(tǒng)計(jì)囊胚數(shù)量、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)。

1.3 細(xì)胞核的染色和計(jì)數(shù)

統(tǒng)計(jì)囊胚的細(xì)胞數(shù)。使用Van等[15]描述的方法并稍作改進(jìn)，對(duì)發(fā)育至囊胚階段的胚胎進(jìn)行細(xì)胞核染色。將透明帶完整的囊胚轉(zhuǎn)移至洗液(PBS+0.2%BSA)中洗滌2次，轉(zhuǎn)移至通透液(PBS+0.25% Triton X-100)中 5 min，洗液洗滌2次，在DAPI液中染色4 min，隨后再用洗液洗滌3次。最后用一滴抗熒光淬滅劑將胚胎固定在玻璃載玻片上，用蓋玻片覆蓋胚胎并壓片，熒光顯微鏡拍照并對(duì)囊胚細(xì)胞核計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.4 受體羊胚胎移植

保證受體羊在移植時(shí)所處的生殖系統(tǒng)狀態(tài)與胚胎發(fā)育時(shí)期處于同期。受體羊與供體羊同步埋栓，在供體注射第5針FSH時(shí)，受體羊撤栓并肌肉注射PMSG(330 IU/只)。受體羊手術(shù)前24 h 禁食禁水。

早期胚胎(2～8細(xì)胞期)移植：將早期胚胎吸入移植針管，以常規(guī)手術(shù)將受體羊卵巢和輸卵管暴露于體外，將移植管插入輸卵管傘部深入5～10 cm，將胚胎注入輸卵管內(nèi)，稍作停留，撤出移植管。

囊胚移植：腹腔鏡手術(shù)，找到受體母羊的子宮角，將子宮角順勢(shì)緩慢牽引出體外，露出子宮角末端，用滅菌處理的回形針尖在子宮角上穿刺打孔，移植針通過孔徑將囊胚注入子宮角內(nèi)。同時(shí)肌肉注射黃體酮(0.1 mL/只)。

1.5 胚胎移植對(duì)懷孕率的影響實(shí)驗(yàn)分組

第1組為移植不同數(shù)量的卵裂快或慢早期胚胎：①單枚卵裂快的早期胚胎，②雙枚卵裂快的早期胚胎，③單枚卵裂慢的早期胚胎，④雙枚卵裂慢的早期胚胎。第2組為移植不同數(shù)量的囊胚：⑤單枚囊胚，⑥雙枚囊胚。第3組為受精后不同時(shí)間移植卵裂快的早期胚胎：受精后24 h 時(shí)移植，受精后48 h 時(shí)移植。第4組為移植經(jīng)形態(tài)學(xué)分級(jí)的卵裂快組早期胚胎。卵裂快組早期胚胎培養(yǎng)至48 h進(jìn)行形態(tài)學(xué)質(zhì)量綜合評(píng)分，分為A和B級(jí)，進(jìn)行單胚移植，同時(shí)設(shè)一個(gè)不分級(jí)的隨機(jī)單胚移植作對(duì)照組。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：A級(jí)胚胎(卵裂球大小均勻且數(shù)目均等，胞質(zhì)均勻、胞內(nèi)無空泡，碎片不超過5%的胚胎)；B級(jí)胚胎(卵裂球大小均勻或大致均勻，數(shù)目均等或大致均等，胞質(zhì)均勻、胞內(nèi)無空泡，碎片占5%～10%的胚胎)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

記錄體外胚胎生產(chǎn)過程中的卵裂率(卵裂胚胎數(shù)/可用卵數(shù))，囊胚率(囊胚數(shù)/卵裂胚數(shù))。胚胎移植40～45 d，用B超檢測(cè)受體懷孕率(懷孕母羊數(shù)/移植受體數(shù))。采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的 t 檢驗(yàn)或LSD對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)和百分率 (%) 表示，P<0.05 為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎卵裂快慢所占比例

由圖1顯示，在24 h 觀察到的胚胎卵裂數(shù)是1916枚，卵裂率是69.15%；24～36 h 的新增卵裂胚胎456枚，卵裂率是16.28%；36～48 h新增卵裂胚胎89枚，卵裂率是3.15%。3個(gè)時(shí)間段的卵裂率差異極顯著(P<0.01)。其中快卵裂胚數(shù)占總卵裂胚胎數(shù)的77.85%(1916/2461)。

圖1 綿羊體外胚胎不同時(shí)間段卵裂率Fig.1 Cleavage rate of sheep embryos in vitro at different time

2.2 卵裂快、慢胚胎的發(fā)育潛能分析

將不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)卵裂的胚胎分組培養(yǎng)至第7 天，表1顯示，受精24 h卵裂的胚胎囊胚率達(dá)68.95%，受精24～36 h卵裂的胚胎囊胚率為26.91%，受精36～48 h 卵裂的胚胎囊胚率僅為7.65%；卵裂快的胚胎囊胚率極顯著高于卵裂慢的胚胎。

表1 綿羊不同時(shí)間卵裂胚胎的發(fā)育效率Table 1 Development efficiency of sheep embryos with different cleavage time

卵裂速度不同的胚胎發(fā)育成的囊胚細(xì)胞數(shù)也不同。從不同組囊胚中各取20枚進(jìn)行細(xì)胞核染色并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。卵裂快組囊胚細(xì)胞數(shù)為135.67±2.31，24～36 和36～48 hpi 卵裂慢組的囊胚細(xì)胞數(shù)分別為 83.3±2.43 和50.21±4.11。卵裂快組與卵裂慢組囊胚的細(xì)胞數(shù)差異極顯著(P<0.01)，且卵裂快組胚胎發(fā)育成的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞排布比卵裂慢組更緊密(圖2)。

A.12～24 hpi卵裂胚發(fā)育的囊胚；B.24～36 hpi卵裂胚發(fā)育的囊胚；C.36～48 hpi卵裂胚發(fā)育的囊胚。圖中比例尺代表50 μmA.Blastocysts developed from 12-24 hpi cleavage embryos; B.Blastocysts developed from 24-36 hpi cleavage embryos; C.Blastocysts developed from 36-48 hpi cleavage embryos; The scale represents 50 μm圖2 不同時(shí)間卵裂綿羊體外胚胎發(fā)育至囊胚的細(xì)胞核染色Fig.2 Fluorescent staining of the nuclei of blastocyst development from sheep in vitro embryos cleaved at different times

2.3 卵裂快慢胚胎發(fā)育時(shí)期及移植數(shù)量對(duì)懷孕率的影響

如表2所示，卵裂快的早期胚胎單枚移植和雙枚移植懷孕率分別是64.05%和65.62%，差異不顯著(P>0.05)。卵裂慢的(24～36 h卵裂)早期胚胎雙枚移植懷孕率是33.89%，極顯著高于單胚移植的11.67%(P<0.01)，但仍顯著低于卵裂快的胚胎(P<0.01)。

表2 移植不同卵裂時(shí)間的體外早期胚胎及胚胎數(shù)對(duì)懷孕率的影響Table 2 Effects of developmental period and number of transferred embryos with different cleavage time on pregnancy rate

囊胚移植單枚和雙枚的懷孕率分別是69.33%和70.46%，差異不顯著(P>0.05)，與卵裂快的早期胚胎單、雙胚移植的懷孕率比較，也無顯著差異(P>0.05)，但極顯著高于卵裂慢的早期胚胎移植組(P<0.01)。

2.4 體外培養(yǎng)早期胚胎移植時(shí)間對(duì)懷孕率的影響

如表3所示，將受精后24 h卵裂的早期胚胎立即移植，或者繼續(xù)培養(yǎng)至48 h 再進(jìn)行移植的懷孕率分別是64.31%和64.05%，兩者差異不顯著(P>0.05)。

表3 體外培養(yǎng)早期胚胎不同移植時(shí)間對(duì)懷孕率的影響Table 3 Effect of different transplantation time of early embryo culture in vitro on pregnancy rate

2.5 胚胎形態(tài)學(xué)分級(jí)對(duì)懷孕率的影響

如表4所示，移植A級(jí)早期胚胎的懷孕率為63.46%，B級(jí)為63.07%，稍低于對(duì)照組的66.02%，三者統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)。

表4 早期胚胎形態(tài)學(xué)質(zhì)量評(píng)分對(duì)懷孕率的影響Table 4 Effect of early embryo morphology on pregnancy rate

3 討 論

綿羊體外胚胎生產(chǎn)結(jié)合胚胎移植技術(shù)，不僅可以將無法排卵的純種肉羊母羊“廢物利用”，還便于胚胎長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸，高效利用了良種肉羊配子資源，顯著提高了繁殖效率[16]。非損傷性高質(zhì)量胚胎的選擇、移植時(shí)期及移植數(shù)量都可能影響受體的懷孕率，從而影響獲得后代的數(shù)量和經(jīng)濟(jì)效益。哺乳動(dòng)物合子第一次卵裂時(shí)間被認(rèn)為是胚胎發(fā)育潛力的非損傷性標(biāo)記，在人類輔助生殖中已進(jìn)行較為深入的研究。目前對(duì)綿羊體外胚胎根據(jù)卵裂快慢標(biāo)記進(jìn)行高效利用的研究尚未見詳細(xì)報(bào)道。本項(xiàng)目以杜泊肉羊?yàn)閷?duì)象，研究胚胎卵裂快慢與其發(fā)育潛能的關(guān)系以及對(duì)移植懷孕率的影響。

人類卵母細(xì)胞體外受精首次卵裂時(shí)間被認(rèn)為是胚胎發(fā)育潛力的非損傷性標(biāo)記，用以識(shí)別優(yōu)質(zhì)胚胎。Edwards等[17]和Van等[18]在人類輔助生殖過程中發(fā)現(xiàn)，早(快)卵裂胚胎具有高質(zhì)量的發(fā)育潛能，優(yōu)先用作輔助生殖移植胚胎?，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)為，早卵裂是人類、豬和牛胚胎發(fā)育能力的重要標(biāo)志事件[6,19-22]，可用于優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇。

通常在受精后的24、36 和 48 h 3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)段觀察卵裂情況，判斷首次卵裂時(shí)間。不同物種合子卵裂時(shí)間范圍是有差異的。比如人類合子首次卵裂時(shí)間范圍在22～30 hpi[23-24]，大部分集中在24 hpi[24]；牛合子首次卵裂時(shí)間范圍在22～48 hpi，在36 hpi 時(shí)2細(xì)胞期胚胎達(dá)到高峰[19,25]；綿羊胚胎合子卵裂時(shí)間在18～36 hpi[9]，本研究結(jié)果顯示，受精24 h即卵裂的胚胎所占比例顯著高于24 h以后組。本研究中卵裂快胚胎的囊胚發(fā)育率極顯著高于卵裂慢胚，與Fryc等[9]認(rèn)為早卵裂比晚卵裂受精卵更容易發(fā)育到囊胚期的研究結(jié)論一致；Matsuura等[26]在對(duì)牛的體外胚胎研究中發(fā)現(xiàn)胚胎內(nèi)的細(xì)胞數(shù)與其體外發(fā)育能力成正比，本研究也發(fā)現(xiàn)卵裂快胚胎發(fā)育得到的囊胚內(nèi)細(xì)胞數(shù)最多，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)緊密。

根據(jù)胚胎發(fā)育的不同時(shí)期，在受體生殖道中移植的位置也有所不同。通常2～8細(xì)胞胚胎進(jìn)行輸卵管移植，而桑椹胚和囊胚則是子宮角移植。移植人受精2～3 d(卵裂期)的胚胎與4～5 d(桑葚胚/囊胚)的胚胎妊娠率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒有顯著差異[27-28]，但從早期胚胎培養(yǎng)至囊胚，可移植的胚胎數(shù)量則顯著減少[29]。綿羊每個(gè)受體移植3～4枚IVP早期卵裂胚受胎率可達(dá)50%～80%[29-30]。郭延華等[31]移植單枚優(yōu)質(zhì)早期卵裂胚懷孕率可達(dá)43%～58%，雙枚優(yōu)質(zhì)胚懷孕率為53%。綿羊體內(nèi)胚胎2細(xì)胞、4～8細(xì)胞胚胎及囊胚分別移植受體，2細(xì)胞胚胎移植懷孕率為42%，而4～8細(xì)胞期移植懷孕率高達(dá)67%，與囊胚移植受胎率(70%)差異不顯著(P>0.05)[30,32]。假定2細(xì)胞胚胎和4～8細(xì)胞胚胎體內(nèi)受精時(shí)間大致相同，但沖出體外時(shí)胚胎發(fā)育時(shí)期不同，推測(cè)2細(xì)胞胚胎屬于慢卵裂胚，而4～8細(xì)胞期胚胎即快卵裂胚，所以2細(xì)胞胚胎移植后的懷孕率顯著低于4～8細(xì)胞期胚胎。這與本研究中綿羊體外胚胎的移植懷孕率結(jié)果一致，即移植卵裂快的早期胚胎懷孕率高于卵裂慢的早期胚胎，而同樣本研究中囊胚移植懷孕率雖略高于快卵裂胚，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)移植單枚或雙枚卵裂快的胚胎懷孕率差異不顯著，而移植單枚卵裂慢的胚胎懷孕率顯著低于雙胚移植。前期本項(xiàng)目組未對(duì)胚胎卵裂快慢進(jìn)行研究，在受精48 h時(shí)進(jìn)行移植，單枚早期胚胎的受胎率顯著低于雙胚移植，可能與卵裂較慢胚胎占比較高有關(guān)[10]。表明移植胚胎的質(zhì)量是影響懷孕率的主要因素，而移植胚胎的數(shù)量只對(duì)質(zhì)量較差的慢卵裂胚的懷孕率產(chǎn)生影響?？炻蚜言缙谂咛フ伎偮蚜雅咛サ谋壤^70%，且卵裂的時(shí)間較集中，如果遵循越早進(jìn)入體內(nèi)越有利于胚胎發(fā)育著床的原則，則需要多臺(tái)手術(shù)同時(shí)移植，意味著需要更多熟練手術(shù)操作的人員投入。因此本研究探究了快卵裂早期胚胎在不同時(shí)間移植對(duì)懷孕率的影響，發(fā)現(xiàn)在24或48 hpi移植，懷孕率結(jié)果差異不顯著，那么對(duì)應(yīng)受體移植的時(shí)間窗口就可以設(shè)置在24～48 hpi，增加了移植手術(shù)安排和操作的靈活性和方便性。因此，合理地移植早期卵裂胚可顯著提高體外胚胎利用效率。

胚胎形態(tài)學(xué)質(zhì)量評(píng)分也可能影響移植受胎率。有研究發(fā)現(xiàn)A級(jí)桑葚胚單枚移植懷孕率顯著低于雙枚移植； B級(jí)桑葚胚單枚移植懷孕率低于雙枚移植,而且A級(jí)胚懷孕率顯著高于B級(jí)胚[32-33]。本研究對(duì)快卵裂胚培養(yǎng)至48 h時(shí)進(jìn)行形態(tài)分級(jí)并分別移植受體，但懷孕率差異并不顯著。這表明快卵裂早期胚胎形態(tài)學(xué)質(zhì)量評(píng)定對(duì)胚胎移植的指導(dǎo)意義不大，無法從形態(tài)上準(zhǔn)確區(qū)分早期胚胎的質(zhì)量。

囊胚移植具有較高的懷孕率。移植綿羊雙枚體內(nèi)生產(chǎn)的囊胚，懷孕率達(dá)70%～90%, 產(chǎn)羔率為59%～67%[34-35]。雙枚或多枚體外綿羊囊胚移植懷孕率也有47%～70%[30,36-38]。本研究中體外生產(chǎn)囊胚單、雙胚移植的懷孕率為69.33%和70.46%，無顯著差異。因此，建議體外生產(chǎn)囊胚多采用單胚移植。另外，體外生產(chǎn)綿羊囊胚與卵裂快早期胚胎的移植懷孕率也無顯著差異，均達(dá)到65%左右，已知體外胚胎生產(chǎn)中囊胚發(fā)育率通常在40%～60%，說明可用于移植的囊胚數(shù)量相較于可移植的早期胚胎數(shù)量減少了近半數(shù)，因此，移植早期快卵裂胚不僅可以將移植時(shí)間提前，縮短胚胎移植實(shí)驗(yàn)安排的整體時(shí)間，提高時(shí)效性；還可以增加可用于移植的胚胎數(shù)量，提高胚胎利用率。

4 結(jié) 論

綿羊體外胚胎生產(chǎn)后，應(yīng)分別在受精后24和36 h挑選卵裂的早期胚胎并分開培養(yǎng)。受精24 hpi以內(nèi)卵裂卵裂的胚胎以單枚移植為主，超過24 hpi 卵裂的胚胎以移植雙枚為主。并且早期快卵裂胚胎無需對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行鑒定，隨機(jī)移植即可。囊胚移植應(yīng)以單枚移植為主。該移植方案能有效提高綿羊體外胚胎的利用率。