光化學(xué)衍生法測(cè)定玉米及玉米制品中的黃曲霉毒素B1

劉夢(mèng)佳，任肖峰，鄭大威，林太鳳，張萍，王惠琴

（1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124；2.北京開課吧科技有限公司，北京 100193）

黃曲霉毒素（AFT）是由曲霉屬中的黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的具有致癌性和免疫抑制作用的次生代謝產(chǎn)物，常存在于發(fā)霉的大豆、稻谷、玉米等農(nóng)產(chǎn)品中，是食品污染的一個(gè)重要來源（Chen等，2021）。它們是一類結(jié)構(gòu)相似的化合物的總稱，基本結(jié)構(gòu)都是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)?，有黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素M1（AFM1）等20種，大多難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑（如氯仿、丙酮、甲醇和乙醇等），熔點(diǎn)為200～ 300 ℃，耐高溫，常規(guī)的加熱處理難以將其分解。其中，AFB1毒性最強(qiáng)，是砒霜的68倍，被列為一類致癌物（Tan等，2019；Wu等，2018；上海飛測(cè)生物科技有限公司，2017；Rejeb等，2009）。當(dāng)人體攝入被黃曲霉毒素污染的食品時(shí)，會(huì)發(fā)生急性中毒（導(dǎo)致肝臟出血、壞死）或慢性中毒（導(dǎo)致肝功損害），甚至發(fā)生癌變（王喜萍，2004）。我國(guó)嚴(yán)格限制規(guī)定食品中AFB1的量，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）規(guī)定，玉米、玉米面（渣、片）及玉米制品AFB1不超過20 μg/kg（國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)等，2017）。

目前，檢測(cè)糧食中AFB1的方法主要有薄層色譜（TLC）法（Sassahara等，2005；環(huán)境科學(xué)叢刊，1980）、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法（王彩云，2007）、高效液相色譜（HPLC）法（王艷紅等，2019；Shuib等，2017；Campone等，2016）等。近些年也有新方法不斷被開發(fā)利用，例如熒光原位雜交（FISH）法（許琳，2018）、生物傳感器法（張軍鵬，2020；Zhu等，2020）和高效液相色譜熒光檢測(cè)器（HPLCFL）法（Ketney等，2017）等。HPLC-FL 法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，近年來在黃曲霉毒素的檢測(cè)中應(yīng)用越來越廣泛。由于AFB1在遇水后會(huì)發(fā)生熒光淬滅，因此液相色譜法在檢測(cè)時(shí)通常需要衍生，其中光化學(xué)柱后衍生法簡(jiǎn)單方便（朱鵬飛等，2016）。

玉米作為我國(guó)的高產(chǎn)糧食作物，是畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等的重要飼料來源，也是食品、醫(yī)療衛(wèi)生、輕工業(yè)、化工業(yè)等不可或缺的原料之一，玉米和玉米制品在我國(guó)的國(guó)計(jì)民生和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著巨大的作用。但是，由于儲(chǔ)藏條件的問題，玉米和玉米制品經(jīng)常會(huì)受到真菌污染，其中黃曲霉毒素污染普遍，且以AFB1為主。本文結(jié)合免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行富集凈化，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器-光化學(xué)柱后衍生法，測(cè)定玉米和玉米制品中的AFB1，以期為玉米和玉米制品中AFB1的檢測(cè)提供準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 玉米及玉米制品（玉米粒和玉米片，市售）；甲醇（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）：純度≥99%，帶標(biāo)準(zhǔn)證書；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore（Direct-Q 8UV-R）所制超純水（18.2 mΩ）；AFB1免疫親和柱（3 mL，北京百靈威科技有限公司）；玻璃纖維濾紙（青島普瑞邦生物工程有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備 LC-100 高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器，）；AL204分析天平（Mettler Toledd 公司）；旋渦混合器；干式氮吹儀；PHREDHMC 光化學(xué)衍生器（220 V，50 Hz，8 W）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：XDB-C18 柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（V:V，45：55）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；熒光檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量：20.0 μL；分析時(shí)間：15 min。

1.3.2 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用分析天平稱取黃曲霉毒素B1粉末1.0 mg，用100 mL 色譜甲醇充分溶解后，全部轉(zhuǎn)移至1000 mL 容量瓶中，用色譜甲醇定容至刻度，得到1.0 mg/L 的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后依次用色譜甲醇稀釋得到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 的AFB1溶液。在設(shè)定的色譜條件下，濃度由低到高進(jìn)行進(jìn)樣，采用外標(biāo)法定量，作峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.3.3 試樣的制備與凈化 將玉米及玉米制品粉碎，稱取均勻的玉米及玉米制品粉末50.00 g 于250 mL 具塞錐形瓶中，加入100 mL 甲醇-水（55：45，V/V）溶液，渦旋混勻，10000 r/min 下均質(zhì)3 min，再在10000 r/min 下離心5 min，取上清液備用。

使用30 mL 超純水稀釋15 mL 上清液，再用玻璃纖維濾紙進(jìn)行過濾，移取15 mL 稀釋液，過免疫親和柱凈化，將流速控制在1.0 mL/min 以內(nèi)，使黃曲霉毒素B1被完全吸附。取10 mL水，分兩次淋洗免疫親和柱，將小柱抽干，棄去流出液。加入3 mL 甲醇對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，收集全部流出液，并用N2吹干。加入1 mL 色譜級(jí)甲醇復(fù)溶樣品，過0.22 μm 的濾膜，供HPLC 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜圖 在1.3.1 的條件下，分別用高效液相色譜測(cè)定甲醇（色譜純）和色譜甲醇溶解的AFB1溶液，得到兩者的高效液相色譜圖見圖1，確保色譜甲醇不會(huì)對(duì)AFB1的測(cè)定造成影響。從圖1 可見，使用高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素時(shí)，甲醇不會(huì)對(duì)AFB1的測(cè)定造成影響，AFB1的保留時(shí)間為8.2 min。

圖1 黃曲霉毒素B1 的高效液相色譜圖

再將配制的0.1～ 0.5 mg/L AFB1溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2?？梢夾FB1的濃度在0.1～0.5 mg/L時(shí)，其峰面積是逐漸增大的，且保留時(shí)間一致，表明沒有受到其他因素的影響。

圖2 0.1～ 0.5 mg/L 黃曲霉毒素B1 的高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限 本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法，配制成“1.3.2”標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)行檢測(cè)分析。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y 進(jìn)行線性關(guān)系分析，得到AFB1的峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系，擬合回歸方程式，詳見圖3。以S/N=3 和S/N=10 確定最低檢出限和定量檢出限。結(jié)果表明，該方法在0.1～ 0.5 mg/L 內(nèi)線性關(guān)系良好，且檢出限低，可以用于試樣中AFB1的分析檢測(cè)，詳見表1。本研究方法中，以0.1～ 0.5 mg/L 作為標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，與國(guó)標(biāo)相比（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局等，2018；國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)等，2016），線性范圍較窄，方法的檢出限和定量限更有優(yōu)越性。

圖3 黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 黃曲霉毒素B1 的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

2.3 加標(biāo)回收率和重復(fù)性 在玉米和玉米制品樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)AFB1溶液，使其在樣品中的含量分別為5、10 μg/kg，按照1.3.3 中的操作步驟進(jìn)行處理，對(duì)每個(gè)水平做5 次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算AFB1的平均回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

表2 黃曲霉毒素B1 的加標(biāo)回收率和重復(fù)性

結(jié)果表明，用該方法得到的色譜圖，AFB1的保留時(shí)間是恒定的。AFB1的回收率在85%以上，平均回收率為88.4%～ 90.1%，RSD 值為0.47%～1.07%，方法準(zhǔn)確度高，符合AFB1分析檢測(cè)要求。

2.4 市售玉米和玉米制品中黃曲霉毒素B1測(cè)定在農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)購(gòu)買玉米粒和玉米片各三份分別用于測(cè)定。按照1.3.3 中的方法進(jìn)行樣品處理，按照1.3.1中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如表3 所示。購(gòu)買的三份玉米粒和三份玉米片中均未檢出AFB1，反映出市場(chǎng)管控情況較好。

表3 市售玉米和玉米制品中黃曲霉毒素B1 測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)的方法測(cè)定玉米和玉米制品中AFB1的含量。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，該方法采用了光化學(xué)衍生器進(jìn)行柱后衍生，既增強(qiáng)了AFB1的檢測(cè)靈敏度，又避免了化學(xué)衍生過程帶來的試劑污染；另一方面改進(jìn)了AFB1的提取和固相萃取洗脫過程，使得AFB1的回收率為88.4%～ 90.1%，RSD 為0.47%～ 1.07%。本研究所建立的方法回收率高、適應(yīng)性強(qiáng)，可為玉米等谷物中AFB1污染的監(jiān)測(cè)提供可靠的依據(jù)。