超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定飼料中6 種多肽類抗生素

喬穎，袁奎敬，韓鳳麗，葛祥武，劉雪紅，黨媛媛

（大連市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116037）

多肽類抗生素（polypeptide antibiotics）是從多黏桿菌或產(chǎn)氣孢子桿菌的培養(yǎng)液中提取具有多肽結(jié)構(gòu)特征的一類抗生素，常用類型包括桿菌肽、恩拉霉素、維吉尼亞霉素、那西肽等。多肽類抗生素可對抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、綠膿桿菌等的感染，廣泛應(yīng)用于家禽、豬、牛等飼料和獸藥中，具有預(yù)防動物疾病、促進(jìn)動物生長等作用（劉靜等，2019；錢卓真等，2016；呂惠序，2013；葉婷婷等，2011；孫興權(quán)等，2008；Daghighian等，1982）。近年來，隨著多肽類抗生素的廣泛使用，不合理使用問題時(shí)有發(fā)生，致使致病菌耐藥性問題日益嚴(yán)重（何夢如等，2020；吉艷艷，2019）。對此，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布 《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第194 號》，明確要求自2020 年1 月1 日起，退出除中藥外所有的促生長類藥物飼料添加劑品種，這其中就包括多種多肽類抗生素。因此，針對禁抗品種，建立飼料中多種多肽類抗生素的檢測方法對于飼料監(jiān)管意義重大。

目前關(guān)于多肽類抗生素的檢測方法主要有微生物法（王正彬等，2015；郭桂芳等，2014）、酶聯(lián)免疫吸附法（劉宏軍等，2013）、毛細(xì)管電色譜-激發(fā)誘導(dǎo)熒光法等（雷霄云等，2018）。微生物法是多肽類抗生素檢測應(yīng)用比較早也比較廣泛的一種方法，但是存在靈敏度低、單次實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長等缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)用也比較受限。近年來，隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用的日益廣泛，已有文獻(xiàn)報(bào)道采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定飼料中多肽類抗生素的檢測方法（聶貞等，2021；張艷等，2020；趙靜等，2020；杜鑫等，2018；曹文卿等，2015；曹文卿等，2012；黃永輝，2011），但這些方法大多檢測指標(biāo)單一，且前處理比較繁瑣費(fèi)時(shí)。為此，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定飼料中6 種多肽類抗生素，利用通過型PRiME HLB 固相萃取柱對樣品進(jìn)行凈化，實(shí)現(xiàn)對飼料中多肽類抗生素的快速、準(zhǔn)確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 桿菌肽（桿菌肽A 純度為47.1%、桿菌肽B 純度為28.9%），德國Dr.Ehrenstorfer 公司；恩拉霉素A（純度為97.3%）、恩拉霉素B（純度為89.2%），美國TOKU-E 公司；維吉尼亞霉素M1（純度為99.3%）、維吉尼亞霉素S1（純度為99.5%），以色列FERMENTEK 公司。乙腈、甲醇、甲酸（色譜純），美國Fisher 公司；鹽酸（分析純），天津科密歐試劑有限公司；Oasis HLB 固相萃取柱（3 mL，60 mg），美國Waters 公司；Oasis PRiME HLB 柱（3 mL，60 mg），美國Waters 公司；Captive EMR Lipid 凈化柱（6 mL，600 mg），美國安捷倫公司；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q 超純水；0.22 μm GHP 濾膜，美國Waters 公司。

1.2 儀器與設(shè)備 Waters Xevo TQ-S 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters 公司；IKA MS3 混合漩渦儀，德國IKA 公司；CF16RX 型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；KQ-250B 型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器，美國Millipore 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 分別稱取恩拉霉素A 和B，維吉尼亞霉素M1和S1各標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度均為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃條件下貯存。

稱取桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解并定容，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃條件下貯存。

1.3.2 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液 取飼料空白樣品，按照1.4.3 樣品前處理方法進(jìn)行提取凈化，得到空白基質(zhì)溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配成恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/L，維吉尼亞霉素M1和S1質(zhì)量濃度為2.5、5、10、25、50、100 μg/L 的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：0.1%甲酸乙腈（A 相）-0.1%甲酸水溶液（B 相）；梯度洗脫程序：0～ 2.0 min，95%～ 70% B;2.0～ 4.0 min，70%～20%B;4.0～5.1 min，20%～95%B；7.5 min，95% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1000 L/h。

1.4.3 樣品前處理 提取：稱取1 g 飼料樣品（準(zhǔn)確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，準(zhǔn)確加入5 mL 0.1 mol/L 鹽酸水溶液/乙腈（3：7，V/V），渦旋1 min，超聲提取10 min，4 ℃下10000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。再向殘?jiān)屑尤? mL 提取液，重復(fù)以上提取操作，合并兩次上清液。

凈化：取上述上清液適量，注入Oasis PRiME HLB 固相萃取柱中，將濾液收集于10 mL 離心管中，用0.22 μm 濾膜過濾后，供UPLC-MS/MS 儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)比較了使用甲醇和乙腈作為有機(jī)相時(shí)，6 種多肽類抗生素響應(yīng)大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，6 種多肽類抗生素的響應(yīng)均較高，因此選擇乙腈作為流動相中的有機(jī)相部分。另外，由于采用正離子模式檢測，甲酸可以為陽離子的形成提供必要的質(zhì)子來源，來提高質(zhì)子化效率（Kaufmann等，2013），同時(shí)甲酸可以使色譜柱內(nèi)的硅膠硅醇基質(zhì)子化，從而減弱硅醇基與待測物的相互作用，減少色譜峰拖尾，使得色譜峰響應(yīng)好峰形佳，因此最終選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。調(diào)整流動相梯度，使6 種多肽類抗生素實(shí)現(xiàn)較好的分離效果。優(yōu)化后的色譜圖如圖1 所示。桿菌肽B有多個(gè)同分異構(gòu)體，在本實(shí)驗(yàn)條件下，桿菌肽B產(chǎn)生兩個(gè)無法分離的色譜峰，因此本實(shí)驗(yàn)以桿菌肽B 總峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 6 種多肽類抗生素是由氨基酸縮合而成的肽類物質(zhì)，分子質(zhì)量較大，其分子質(zhì)量在525～ 2369。在進(jìn)入一級質(zhì)譜后，易與一個(gè)或多個(gè)H+結(jié)合，產(chǎn)生帶正電的單電荷或多電荷離子（Song等，2018）。實(shí)驗(yàn)中，向儀器中注入100 μg/L 的6 種待測物混標(biāo)，在正離子條件下進(jìn)行全掃描，維吉尼亞霉素M1和S1在一級質(zhì)譜中能產(chǎn)生豐度較大的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰；桿菌肽A 和B、恩拉霉素A 和B 在進(jìn)入一級質(zhì)譜后能產(chǎn)生不同豐度的雙電荷離子和三電荷離子，通過實(shí)驗(yàn)觀察，三電荷離子（[M+3H]3+）的離子豐度明顯大于雙電荷離子（[M+2H]2+），因此對于以上4 種多肽類抗生素采用[M+3H]3+作為準(zhǔn)分子離子峰。通過比較母離子的信號強(qiáng)度來優(yōu)化錐孔電壓，比較子離子的信號強(qiáng)度來優(yōu)化碰撞能，優(yōu)化后的質(zhì)譜采集參數(shù)如表1 所示。

表1 6 種多肽類抗生素的分子質(zhì)量和質(zhì)譜采集參數(shù)

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的選擇 根據(jù)各類多肽類抗生素溶解性的不同：桿菌肽類易溶于水，且在弱酸性條件下比較穩(wěn)定，恩拉霉素易溶于鹽酸，維吉尼亞霉素易溶于乙腈等有機(jī)溶劑（Wu等，2020；Boison等，2015）。同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)中報(bào)道的相應(yīng)提取試劑，本方法擬采用0.1 mol/L 鹽酸水溶液-乙腈作為提取試劑，并對水相和有機(jī)相的體積比進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中比較了體積比分別為5：5，3：7，2：8 三種比例提取試劑的提取效果，以飼料樣品中添加0.5 mg/kg 待測物，各待測物的提取回收率為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見圖2。從圖2 中可以觀察到，當(dāng)0.1 mol/L 鹽酸水溶液與乙腈的體積比為5：5時(shí)，桿菌肽A 和B、維吉尼亞霉素M1和S1的提取回收率均低于體積比3：7，恩拉霉素A 和B 的提取回收率與體積比3：7 持平；當(dāng)二者體積比為2：8時(shí)，6 種待測物的提取回收率均比體積比3：7 低。綜合考慮選擇0.1 mol/L 鹽酸水溶液與乙腈的體積比為3：7 的混合溶液作為最終提取液。

圖2 0.1 mol/L 鹽酸水溶液與乙腈的不同體積比對6 種多肽類抗生素提取回收率的影響（n=3）

2.2.2 凈化方法的選擇 飼料產(chǎn)品種類繁多，基質(zhì)復(fù)雜，因此必須要對樣品的提取液進(jìn)行凈化處理，以減少雜質(zhì)對待測物的干擾，并降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)比較了采用HLB 固相萃取柱、Captive EMR Lipid 凈化柱以及通過型PRiME HLB 固相萃取柱的凈化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用HLB 固相萃取柱時(shí)，需要經(jīng)過活化、上樣、淋洗、洗脫等步驟，而且上柱液過柱緩慢，凈化耗時(shí)較長，凈化后待測物回收率較低，其中恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 的回收率均小于30%；采用Captive EMR Lipid 凈化柱時(shí)，凈化后溶液較渾濁，基質(zhì)效應(yīng)對前端出峰的恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 的影響較大；采用通過型PRiME HLB 固相萃取柱時(shí)，待凈化液可實(shí)現(xiàn)一步凈化，操作簡單，凈化后溶液澄清，樣品回收率均大于80%。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)和線性 基質(zhì)效應(yīng)是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用ESI 接口最常見的問題。實(shí)驗(yàn)通過比較6 種多肽類抗生素在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上的相對響應(yīng)值（基質(zhì)匹配標(biāo)液響應(yīng)值/純標(biāo)液響應(yīng)值）來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（肖志明等，2021）。恩拉霉素A 和B 的相對響應(yīng)值分別為70.8%、72.4%，桿菌肽A 和B 的相對響應(yīng)值分別為69.3%、64.4%、維吉尼亞霉素M1和S1的相對響應(yīng)值分別為124%、116%，表明恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 存在基質(zhì)抑制現(xiàn)象，維吉尼亞霉素M1和S1存在基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象。因此，本研究擬采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

將基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液上機(jī)進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，定量MRM 離子對的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程如表2 所示。結(jié)果表明，恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 在質(zhì)量濃度為5～ 200 μg/L 內(nèi)線性關(guān)系良好，維吉尼亞霉素M1和S1在質(zhì)量濃度為2.5～ 100 μg/L 內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9985～ 0.9991。

2.3.2 方法定量限 方法的定量限（LOQ）是指在獲得滿意的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差的前提下，在樣品中可以檢測到目標(biāo)化合物的最低濃度（喬穎等，2021）。本方法中恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B的定量限可實(shí)現(xiàn)0.05 mg/kg，維吉尼亞霉素M1和S1的定量限可實(shí)現(xiàn)0.025 mg/kg，在該水平下的平均添加回收率為83.2%～ 102.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于7.8%，表明該定量限滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求。

2.3.3 回收率和精密度 取空白飼料樣品，設(shè)置2 倍、5 倍、20 倍LOQ 的3 個(gè)添加水平，每個(gè)水平6 個(gè)平行，按照1.4.3 中樣品的前處理方法測定，進(jìn)行方法的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表2 所示，6 種多肽類抗生素的平均回收率為83.2%～112.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.3%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均良好，適用于飼料中6種多肽類抗生素的檢測。

表2 6 種多肽類抗生素的回收率、精密度、線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.4 實(shí)際樣品的檢測 為了驗(yàn)證方法的可靠性，應(yīng)用研究中建立的方法，對隨機(jī)抽取的50 批次飼料樣品中的6 種多肽類抗生素進(jìn)行檢測，飼料品種包括濃縮飼料、配合飼料、預(yù)混合飼料、自配料等。其中，在1 份樣品中檢出桿菌肽，含量（以桿菌肽A 和B 總和計(jì)）為6.2 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定飼料中6 種多肽類抗生素的檢測方法，以0.1 mol/L 鹽酸水溶液/乙腈（3：7，V/V）作為提取液，經(jīng)通過型PRiME HLB 固相萃取柱凈化，可實(shí)現(xiàn)對樣品的一步式凈化，極大地節(jié)約了前處理時(shí)間，可以有效地去除樣品中復(fù)雜基質(zhì)干擾，提高待測組分的回收率。恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 在質(zhì)量濃度為5～200 μg/L內(nèi)，維吉尼亞霉素M1和S1在質(zhì)量濃度為2.5～ 100 μg/L 內(nèi)線性關(guān)系良好。6種多肽類抗生素在添加濃度0.025～1.0 mg/kg內(nèi)，平均回收率為83.2%～112.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.8%，準(zhǔn)確度、精密度均滿足方法要求。本方法操作簡便，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于飼料中多肽類抗生素的定性篩查和定量檢測，可為我國的飼料禁抗行動提供有力的技術(shù)支持。