添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對綿羊瘤胃體外發(fā)酵的影響

高俊玲，甄玉國，2，王濤，2，孫喆，2，3，張學(xué)峰，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉農(nóng)博瑞奶?？萍佳邪l(fā)中心 吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全省部共建教育部重點實驗室，吉林長春 130118；2.長春博瑞科技股份有限公司 博士后科研工作站吉林省飼料工程技術(shù)研究中心，吉林長春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

抗菌肽（AMPs）作為一種小分子多肽物質(zhì)，具有廣譜的抗真菌、細(xì)菌、病毒、寄生蟲以及不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點，因此成為最有潛力的抗生素替代品之一（王亞平等，2018）。覃小榮等（2011）用保育豬作為試驗動物來研究抗菌肽替代抗生素對其生長性能與健康的影響，結(jié)果表明，飼喂添加0.5%抗菌肽基礎(chǔ)日糧的保育豬生長效果最好，并且添加0.1%抗菌肽與添加0.3%阿莫西林有相同的飼喂效果。徐博成等（2020）研究抗菌肽對仔豬生長性能、腹瀉率和血液免疫指標(biāo)的影響，結(jié)果表明飼糧添加抗菌肽可以提高仔豬的生長性能和免疫功能，并可降低腹瀉率。三丁酸甘油酯（TB）是一種丁酸前體物，能夠促進(jìn)腸道發(fā)育，改善生長性能，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群（Bedford等，2018），因此成為一種潛在的抗生素替代品。Hou 等（2006）研究表明，日糧中添加三丁酸甘油酯可以提高飼料效率，增加回腸絨毛高度，提高空腸乳糖酶、蔗糖酶和麥芽糖酶活性。張勇等（2016）研究表明，在飼糧中添加0.1%三丁酸甘油酯可以提高仔豬的生長性能，增加血清中IgA、IgG 和IgM 含量。但目前對于抗菌肽和三丁酸甘油酯這兩種添加劑的研究大多集中于單胃動物，對于反芻動物的研究比較少，本試驗旨在探討抗菌肽和三丁酸甘油酯對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的影響，為其在反芻動物的應(yīng)用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用抗菌肽由英惠爾生物科技有限公司（中國北京）提供，三丁酸甘油酯由瑞典柏斯托公司提供。

1.2 試驗設(shè)計 本試驗采用單因素試驗設(shè)計，選用3 只體況良好、體重為（40±2）kg 裝有永久性瘤胃瘺管的綿羊作為試驗動物。飼糧精粗比為50：50，其組成與營養(yǎng)水平如表1 所示。將采集的瘤胃液混勻后分為4組，即對照組（A 組）、抗菌肽組（B組，添加0.03%抗菌肽）、三丁酸甘油酯組（C組，添加0.15%三丁酸甘油酯）和聯(lián)合使用組（D組，添加0.03%抗菌肽+0.15%三丁酸甘油酯），每組每個時間點4 個重復(fù)，體外發(fā)酵試驗在6、12 h和24 h 進(jìn)行樣品采集。

表1 日糧組成和營養(yǎng)水平

1.3 體外發(fā)酵試驗

1.3.1 瘤胃液的采集與緩沖液的配制 晨飼前，采用硬質(zhì)PVC 取樣管從瘤胃內(nèi)不同位置采取瘤胃液，將其迅速混勻，倒入用熱水預(yù)熱后的保溫瓶中，迅速蓋好瓶蓋帶回實驗室。將瘤胃液用4 層紗布過濾，置于39 ℃并無氧的暖瓶中備用。瘤胃液緩沖液的配制參照MenKe 等（1979）的方法，試驗開始前1 h 將緩沖液混勻并通入CO2至無色，放入39 ℃的水浴中預(yù)熱。

1.3.2 體外培養(yǎng) 參照MenKe 等（1988）的體外培養(yǎng)方法，將過濾后的瘤胃液與緩沖液按照1：2的比例混勻加入培養(yǎng)瓶中，持續(xù)通入CO230 s，立即蓋上瓶蓋放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 樣品采集 體外發(fā)酵培養(yǎng)過程中，分別在6、12、24 h 取出培養(yǎng)瓶，停止發(fā)酵，立即用便攜pH 計測定發(fā)酵液pH，并收集發(fā)酵液將其放置于-20 ℃冰箱保存，用于測定揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和氨態(tài)氮（NH3-N）。

1.4 測定指標(biāo)及方法 干物質(zhì)降解率參照郭晨陽等（2020）的方法，pH 用便攜式pH 計測定，NH3-N 濃度參照馮宗慈等（2010）改進(jìn)的比色法測定，VFA 參照周雪飛（2016）的方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2010 對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后，采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s 法多重比較，P ﹤0.05 為差異顯著。試驗結(jié)果以折線圖和柱狀圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對pH 和NH3-N 的影響 由圖1 可知，在整個體外發(fā)酵培養(yǎng)過程中，pH 在不同時間點各組之間差異均不顯著（P ﹥0.05）。由圖2 可知，各個處理組NH3-N 濃度隨著發(fā)酵時間的增加而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，24 h時D 組瘤胃發(fā)酵液中NH3-N 的濃度極顯著高于A、B、C 三組（P ﹤0.01），并且B 組NH3-N 的濃度低于A組，C 組NH3-N 的濃度高于A 組。在6 h 和12 h 時各組之間差異均不顯著（P ﹥0.05）。與對照組相比，添加抗菌肽有降低NH3-N 濃度的趨勢，添加三丁酸甘油酯有增加NH3-N 濃度的趨勢。

圖1 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對pH 的影響

圖2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對NH3-N 的影響

2.2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對干物質(zhì)降解率和發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響 由圖3 可知，在6 h 和12 h時，各組之間干物質(zhì)降解率均沒有顯著性差異（P﹥0.05），在24 h時，B、C 組干物質(zhì)降解率高于對照組，但差異不顯著（P ﹥0.05），D 組干物質(zhì)降解率顯著低于A、B、C 三組（P ﹤0.05）。由圖4 可知，在整個體外發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵產(chǎn)氣量各組之間在不同時間點差異均不顯著（P ﹥0.05）。

圖3 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對干物質(zhì)降解率的影響

圖4 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對產(chǎn)氣量的影響

2.3 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對VFA 的影響由圖5～10 可知，在6 h時，B、D 組瘤胃發(fā)酵液中乙酸和丁酸的濃度顯著高于對照組A 組（P ﹤0.05），異戊酸濃度D 組顯著高于A 組（P ﹤0.05），戊酸濃度B 組顯著高于A 組（P ﹤0.05）。在12 h時，B 組瘤胃發(fā)酵液中戊酸的濃度顯著小于A、C、D三組（P ﹤0.05），其余各個指標(biāo)在12 h 時各組之間差異均不顯著（P ﹥0.05）。在24 h時，A、B、C 三組總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著高于D組，B、C 組乙酸濃度顯著高于D 組（P ﹤0.05），A、B、C 三組丙酸、丁酸和異戊酸濃度顯著高于D 組（P ﹤0.05），其余各組之間差異不顯著（P ﹥0.05），戊酸濃度在24 h時各組之間差異不顯著（P ﹥0.05）。

圖5 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對總揮發(fā)性脂肪酸的影響

圖6 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對乙酸的影響

圖7 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對丙酸的影響

圖8 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對丁酸的影響

3 討論

圖9 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對異戊酸的影響

圖10 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對戊酸的影響

3.1 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對pH 的影響瘤胃內(nèi)pH 是維持瘤胃微生物正常生長繁殖的重要條件，經(jīng)常受到精粗飼料比、日糧干物質(zhì)水平和飼料加工處理等因素影響（王慶麗等，2008），其正常值一般在6.0～ 7.0 波動，高于或低于正常范圍都會直接影響瘤胃的發(fā)酵情況和瘤胃內(nèi)微生物的生長繁殖情況，本試驗中各組瘤胃發(fā)酵液的pH在正常范圍內(nèi)波動，并且隨著發(fā)酵時間的增加pH逐漸下降，24 h 時pH 降到最低，可能是因為培養(yǎng)瓶內(nèi)的有機(jī)酸積累所致。

3.2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對NH3-N 的影響 氨氮（NH3-N）是瘤胃氮素循環(huán)過程中蛋白質(zhì)被生物降解和再利用過程中的中間產(chǎn)物，與非蛋白氮或飼料蛋白質(zhì)的降解速率、菌體蛋白合成速率、能量和碳架供給有關(guān)，其正常濃度為8.5～30 mL/100 mL（王敬堯等，2020）。Liu等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加抗菌肽可以顯著降低瘤胃發(fā)酵液中NH3-N 濃度，與本試驗結(jié)果相似。在本試驗中，12 h 和24 h時，添加抗菌肽的瘤胃發(fā)酵液中NH3-N 濃度要低于對照組，其原因可能是抗菌肽提高了瘤胃微生物對NH3-N 利用效率，從而使NH3-N 合成了較多的菌體蛋白，這與高爽等（2017）研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加復(fù)合抗菌肽會顯著增加山羊瘤胃中菌體蛋白含量的結(jié)果一致。在本試驗中，12 h 和24 h時，添加三丁酸甘油酯的瘤胃發(fā)酵液中NH3-N濃度要高于對照組，可能是因為三丁酸甘油酯可以提高日糧粗蛋白質(zhì)的降解率，這與Ren 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充三丁酸甘油酯可以提高成年綿羊瘤胃日糧粗蛋白質(zhì)的降解率的結(jié)果一致。但是同時添加這兩種物質(zhì)其NH3-N 濃度顯著高于對照組，可能是因為兩種物質(zhì)在瘤胃發(fā)酵液中對NH3-N 發(fā)生正向作用。

3.2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對干物質(zhì)降解率和發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響 干物質(zhì)降解率是指在體外發(fā)酵培養(yǎng)過程中瘤胃內(nèi)微生物對發(fā)酵底物的利用程度（楊晶晶，2020）。劉靖康（2018）研究表明添加抗菌肽CC31 可以顯著提高羔羊瘤胃內(nèi)干物質(zhì)消化率，與本試驗結(jié)果一致，在本試驗中，24 h 時添加抗菌肽瘤胃內(nèi)干物質(zhì)降解率高于對照組，可能是因為抗菌肽抑制了有害菌的生長，從而促進(jìn)了有益菌群對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率提高所致。在本試驗中，24 h 時添加三丁酸甘油酯顯著提高了瘤胃內(nèi)干物質(zhì)降解率，這與Huhtanen 等（1993）研究發(fā)現(xiàn)提高奶牛瘤胃中丁酸的濃度可以提高日糧干物質(zhì)的降解率的結(jié)果一致，可能是因為三丁酸甘油酯改變了瘤胃內(nèi)酶的活性。但是同時添加這兩種物質(zhì)其干物質(zhì)降解率顯著小于對照組，其原因可能是兩種物質(zhì)在瘤胃內(nèi)呈負(fù)相關(guān)作用。

評價飼料發(fā)酵程度的一個重要指標(biāo)就是體外發(fā)酵產(chǎn)氣量。在本試驗中，24 h時，添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對于發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響與干物質(zhì)降解率的結(jié)果相似，兩種物質(zhì)單獨(dú)添加都有增加發(fā)酵產(chǎn)氣量的趨勢，同時添加有減少發(fā)酵產(chǎn)氣量的趨勢。

3.3 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯對VFA 的影響瘤胃中碳水化合物發(fā)酵后所產(chǎn)生的VFA 是反芻動物重要的能量來源，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，約占總揮發(fā)性脂肪酸的95%（李文，2014）。有研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加抗菌肽可以增加瘤胃發(fā)酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量（張萌萌，2020；李世易，2019；Jalc等，2002），與本試驗結(jié)果一致，在本試驗中，24 h時，添加抗菌肽增加了乙酸、丙酸和丁酸的濃度，是因為添加抗菌肽可以影響瘤胃微生物菌群的結(jié)構(gòu)（Ren等，2019）。有研究表明，在日糧中添加三丁酸甘油酯可以增加瘤胃內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等揮發(fā)性脂肪酸的含量（宋志華等，2020；Ren等，2018），這與本試驗結(jié)果一致，在本試驗中，24 h時，與對照組相比，添加三丁酸甘油酯增加了瘤胃內(nèi)發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的含量，其原因可能是三丁酸甘油酯增加了纖維降解酶的活性（Ren等，2018），纖維降解酶在飼糧碳水化合物的降解中發(fā)揮著重要作用（Santra等，2007）。但是在本試驗中，兩者都添加時，乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸都顯著降低，其原因可能是添加的劑量不太合適，使其在瘤胃發(fā)酵液中發(fā)生負(fù)向作用。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，添加抗菌肽和三丁酸甘油酯可以促進(jìn)瘤胃發(fā)酵功能，但同時添加時，不利于瘤胃發(fā)酵。