產β-甘露聚糖酶菌株篩選及制備甘露寡糖產物分析

王佰濤，楊文玲，權淑靜，雷高，李珊珊，劉德海

（河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州 450008）

β-甘露聚糖酶，又稱β-1，4-D-甘露聚糖酶，是能夠水解β-1，4-糖苷鍵的一種內切酶（Srivastava等，2017），在自然界廣泛存在，特別是微生物來源居多，在細菌的芽孢桿菌屬和真菌的曲霉屬比較常見（Piwpankaew等，2014；vanZyl等，2010）。β-甘露聚糖酶在飼料業(yè)、食品業(yè)及植物膠降解等行業(yè)應用較多（Li等，2020；Jeon等，2019），例如，在飼料業(yè)β-甘露聚糖酶可以將飼料中的抗營養(yǎng)因子甘露聚糖轉化為營養(yǎng)性更高、功能性更強的甘露寡糖（Liu等，2021），提高飼料的營養(yǎng)吸收率和飼喂效率（Seo等，2016）。利用其降解植物膠的功能可以水解甘露聚糖生產甘露寡糖，甘露聚糖在植物中主要存在于種子胚乳中用于儲存植物多糖，多來自于豆科植物瓜爾豆提取的瓜爾豆膠（康立新等，2012）、南星科植物魔芋提取的魔芋膠（李小菊等，2013）以及豆科植物刺槐提取的刺槐豆膠等（謝靜靜，2013）。目前工業(yè)上甘露寡糖的制備主要是通過甘露聚糖酶解法進行（Zhang等，2021），不同來源的甘露寡糖在結構和組成上有所不同，主要與β-甘露聚糖酶的來源及所用底物單糖組成有關。在飼料業(yè)甘露寡糖能夠促進動物腸道的消化吸收，調節(jié)動物腸道的微生態(tài)平衡（Giannenas等，2016），減少有害菌在腸道的定植和生長，維持有益菌的動態(tài)平衡（Chao等，2019）。此外，甘露寡糖還能提高動物機體免疫力，減少疾病的發(fā)生（吳峰洋等，2016）。通過分析國內甘露寡糖生產狀況發(fā)現，工業(yè)利用酶解法制備甘露寡糖工藝尚不成熟，因此，發(fā)現新的β-甘露聚糖酶產酶菌株并應用于甘露寡糖的生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 試驗樣品為在河南省濟源市豬場采集的新鮮仔豬糞便。

1.1.2 主要試驗儀器 上海福瑪設備公司QYC2012C 控溫搖床，美國Waters 公司三重四級桿質譜儀，德國Biometra 公司Thermoblock PCR擴增儀，美國Chamber KG-SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，美國Bio-Rad 公司Bio-Rad 分子成像儀，美國SORVALL RC 6PLUS 型高速冷凍離心機，德國zeiss 公司熒光顯微鏡，上海精宏實驗設備有限公司DNP-9082 恒溫培養(yǎng)箱等。

1.1.3 試劑 魔芋膠、瓜爾豆膠、剛果紅、酵母粉、牛肉粉、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、氯化鎂、磷酸二氫鉀等均為國產分析純試劑；細菌DNA 提取試劑盒購自北京索萊寶公司；分子生物學試劑購自華大基因公司；API 生理生化鑒定試劑盒購自梅里埃生物公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g，pH 7.3，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min。

β-甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基：魔芋膠3 g、蛋白胨6 g、酵母粉1 g、氯化鈉0.5 g、剛果紅0.5 g、氯化鎂0.2 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂18 g，pH 6.0，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min。

β-甘露聚糖酶產酶培養(yǎng)基：魔芋膠15 g、硝酸鈉10 g、硫酸亞鐵1 g、氯化鈣1.5 g、氯化鈉1.5 g，pH 7.0，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 采集樣品前準備無菌采樣容器，采集樣品時去除前部和尾部糞便，采集中部糞便樣品，采集后立刻放入無菌容器中。

1.2.2 菌種篩選純化 取河南濟源豬場未滿月新鮮仔豬糞便樣品，稱取1 g 樣品用無菌水制成懸液，然后依次稀釋成10-4、10-5、10-6糞便稀釋液，分別吸取100 μL 涂布于β-甘露聚糖酶篩選平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察透明圈，選擇透明圈較為明顯的菌株，將產酶菌株挑出保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活力測定 將篩選得到的菌株接種于β-甘露聚糖酶產酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h 得到發(fā)酵酶液，而后在4 ℃、12000 r/min條件離心10 min，得到上清液即為β-甘露聚糖酶，參照GB/T 36861-2018 飼料添加劑β-甘露聚糖酶活力測定方法測定β-甘露聚糖酶活力。

1.2.4 外觀形態(tài)鑒定 對保存的產酶菌株挑取單菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板進行培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形態(tài)、外觀等，并進行革蘭氏染色。

1.2.5 生理生化鑒定 利用梅里埃API 鑒定試劑盒對分離菌株進行鑒定。

1.2.5 分子生物學鑒定 利用細菌基因組提取試劑盒對目標菌株的基因組進行提取。而后進行PCR，引物序列：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反應體系50μL：ddH2O21μL，1492R 1.5 μL、27F 1.5 μL，TaqMix 酶25 μL，樣菌模板DNA 1 μL。PCR 程序：94 ℃預變性4 min，96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。而后將PCR 產物送華大基因公司測序。將16S rDNA 序列在NCBI 官網的數據庫進行BLAST 比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行同源性比較分析。

1.2.6 甘露寡糖的制備

1.2.6.1 底物的制備 反應底物選擇魔芋膠和瓜爾豆膠兩種，準確稱取10 g 底物，加入800 mL pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液（GB/T 36861-2018），不斷攪拌并持續(xù)加熱，至底物溶解完全，用pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液定容為1 L，制成1%底物溶液。

1.2.6.2 粗酶液的制備 將篩選得到的菌株接種于β-甘露聚糖酶產酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h 得到發(fā)酵酶液，將發(fā)酵結束后，吸取發(fā)酵液在4 ℃、12000 r/min 條件下離心10 min，棄去沉淀，所得上清液即為β-甘露聚糖粗酶液。

1.2.6.3 甘露寡糖的制備 將酶液和底物溶液按照1：10 體積比混合，在50 ℃水浴反應12 h，得到酶解粗產物。取1 mL 酶解粗產物在12000 r/min、4 ℃條件離心10 min，吸取上清，棄去沉淀，吸取上清液0.5 mL 加入0.5 mL 50%乙醇溶液混勻，在12000 r/min、4 ℃條件離心10 min，吸取上清，棄去沉淀，得到甘露寡糖溶液。

1.2.6.4 甘露寡糖產物分析 甘露寡糖的產物分析采用三重四級桿質譜儀對甘露寡糖成分進行分析。電離模式：電噴霧電離正離子模式，毛細管電壓：3.0 Kv，錐孔電壓：15 V，源溫度：120 ℃，脫溶劑氣溫度：400 ℃，脫溶劑氣流速：560 L/h。上述步驟中得到的甘露寡糖溶液吸取0.5 mL 加入0.5 mL Milli-Q 超純水混勻備用上樣分析。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果 從河南濟源市豬場仔豬糞便中分離得到一株產β-甘露聚糖酶的菌株，編號WBT0011，將其接種于β-甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，所產生的的透明圈如圖1A 所示。營養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈白色，邊緣不整齊，如圖1B 所示。革蘭氏染色為陽性菌，如圖1C 所示。

圖1 菌株外觀形態(tài)

2.2 生理生化鑒定結果 利用梅里埃API 50CHB 和API ZYM 試劑盒及其他生理生化反應對目標菌株進行生理生化鑒定，結果如表1～ 表4，結果發(fā)現其能利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、熊果苷、七葉靈檸檬酸鐵、水楊苷、D-海藻糖作為碳源。不能分解淀粉、纖維素，甲基紅、VP 實驗等結果為陽性，硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原等結果為陰性。通過API ZYM 試劑盒測定目標菌株產酶活性，結果發(fā)現其具有堿性磷酸鹽酶、酯酶、類脂酯酶、類脂酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、苯酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-葡萄糖苷酶活性。

表1 API 50CHB 試劑盒測定碳源利用結果

2.3 分子生物學鑒定結果 對菌株WBT0011 提取基因組后，利用通用引物27F 和1492R 對其進行PCR 擴增，擴增產物的電泳條帶如圖2 所示，擴增片段大小為1485 bp。通過發(fā)育樹軟件MEGA7.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖3 所示。通過PUBMED BLAST 網站分析并與模式菌株比對，發(fā)現其與Bacillus safensis 同源性高達99.52%。結合該菌株的生理生化特征、分子生物學結果和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，最終鑒定該菌為沙福芽孢桿菌。

圖2 PCR 產物電泳圖

圖3 沙福芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4 β-甘露聚糖酶活力測定 將篩選得到的菌株發(fā)酵以后取上清液，然后參照GB/T 36861-2018 飼料添加劑β-甘露聚糖酶活力測定方法測得β-甘露聚糖酶活力為3.8 U/mL。

表2 氮源利用結果

表3 生化特征

表4 API ZYM 酶活性反應

2.5 甘露寡糖產物分析 對質譜結果進行分析（圖4 和圖5），根據峰值的質荷推測魔芋膠水解產物有二糖、三糖、六糖、七糖、十一糖，瓜爾豆膠降解產物有二糖、三糖、四糖、十糖，說明二者水解效果較好，表明篩選得到沙福芽孢桿菌菌株所產β-甘露聚糖酶酶活性較好。

圖4 魔芋膠水解質譜圖

圖5 瓜爾豆膠水解質譜圖

3 討論

本研究從河南濟源豬場的仔豬新鮮糞便中分離得到一株產β-甘露聚糖酶WBT0011，通過該菌株的生理生化特征、分子生物學結果和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，最終鑒定該菌為沙福芽孢桿菌。在動物日糧中添加β-甘露聚糖酶可以有效提高動物的生長性能和養(yǎng)分表觀消化率（薛瑞婷等，2020）。β-甘露聚糖酶能夠去除飼料中甘露聚糖類的抗營養(yǎng)因子，水解為對動物機體更加有利、飼料中應用更多的甘露寡糖（張建新等，2019）。在飼料中添加甘露寡糖能顯著提高動物的抗氧化性能、生產性能，改善動物腸道微生態(tài)平衡（孫盛明等，2014）。目前利用魔芋膠、瓜爾豆膠等甘露聚糖等原料和β-甘露聚糖酶反應制備甘露寡糖生產工藝還有待優(yōu)化提高，新發(fā)現的沙福芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶能夠有效水解魔芋膠和瓜爾豆膠生成二糖、三糖、四糖等多種寡糖，這與尹夢雅（2014）的研究結果一致。

β-甘露聚糖酶在飼料業(yè)應用廣泛，利用微生物方法制備甘露寡糖綠色環(huán)保，流程簡單，甘露寡糖作為一種重要的飼料添加劑，在調節(jié)動物腸道的微生態(tài)平衡，減少有害菌在腸道的定植和生長方面表現良好。通過篩選從仔豬糞便中得到一株產β-甘露聚糖酶的沙福芽孢桿菌WBT0011，表現出較強β-甘露聚糖酶產酶活性，為以后進一步工業(yè)化生產甘露寡糖提供參考。