piRNAs調(diào)控胃癌進程的研究進展

呂夢圓，陳婧，崔宏偉

（1敖漢旗醫(yī)院檢驗科，赤峰 024300；2鄂爾多斯應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，鄂爾多斯017000；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院（內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤醫(yī)院）科研部，呼和浩特 010020）

胃癌（gastric cancer, GC）是全球與癌癥相關(guān)的第三大死亡原因。據(jù)報道，2018年GC造成約780,000例患者死亡[1]。胃腺癌占所有GC病例的95%，并可能伴有隱匿癥狀的癌前病變，這直接導(dǎo)致胃癌確診時常已經(jīng)處于晚期且通常伴有預(yù)后不良[2,3]。因此，開發(fā)和改進GC預(yù)防和管理策略及工具對于胃癌的控制至關(guān)重要。這就需要加強對胃癌的預(yù)防，包括高風險人群的識別、早期診斷和早期患者管理、癌前病變的治療等[4,5]。GC是在胃部正常組織中持續(xù)的分子變化與環(huán)境/行為危險因素共同影響下發(fā)生的，這些因素會破壞胃部正常組織細胞的動態(tài)平衡，獲得在未經(jīng)修復(fù)的情況下導(dǎo)致腫瘤進展的惡性特征[6,7]。因此，深入探討與GC相關(guān)的分子改變，開發(fā)新型的疾病特異性生物標記物和治療靶標顯得尤為重要。

GC相關(guān)的分子改變與體細胞突變密切相關(guān)，這包括可能破壞基因功能的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）或插入缺失（insertion-deletion, INDEL）[8]。INDEL可導(dǎo)致piRNAs序列發(fā)生遺傳變異并改變miRNA結(jié)合位點，從而增加其對包括胃癌在內(nèi)的各種癌癥的敏感性[9]。此外，例如與許多類型的癌癥相關(guān)的調(diào)節(jié)性非編碼RNAs及部分表觀遺傳相關(guān)因子的失衡，影響各種GC進程中的多種調(diào)節(jié)途徑[10]。在所有非編碼RNAs中，有證據(jù)表明piRNAs參與GC進程，具有成為GC預(yù)防及治療的潛在生物標志物的潛力[11,12]。本文將對piRNAs功能及調(diào)控胃癌進程等進行概述，為piRNAs在胃癌的預(yù)防、診斷和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 piRNAs的生物來源

1.1 piRNAs的概念

piRNAs是一種長度約為 25～33nt，調(diào)控mRNA一系列生理功能的調(diào)節(jié)性非編碼RNAs。調(diào)節(jié)性非編 碼RNAs包 括：lncRNA、miRNA、circRNA、siRNA和piRNAs。研究已證實miRNA與siRNA與癌癥的進展密切相關(guān)，提示調(diào)控性非編碼RNAs（例如piRNAs）在基因表達中起重要的調(diào)節(jié)作用，具有作為新的腫瘤標志物的潛力[13]。piRNAs是從干細胞和哺乳動物生殖細胞中分離出來的一類小RNA，與P-element induced wimpy testis (Piwi）蛋白家族聯(lián)合，形成Piwi復(fù)合物來調(diào)控基因沉默。piRNAs的表達具有組織特異性，其主要機制是通過調(diào)控機體干細胞的生長過程、干預(yù)生殖細胞中配子的減數(shù)分裂過程等[14]。

1.2 piRNAs的作用途徑

piRNAs沉默復(fù)合物能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，修飾雙螺旋的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，提示piRNAs可能具有組織特異性表達的特性[15]。piRNAs的作用途徑主要分為兩條：第一條途徑是主要途經(jīng)，首先在細胞核中合成pre-piRNAs，piRNAs隨之生成并且成熟，并將piRNAs和PIWI蛋白連接形成piRNAs沉默復(fù)合體，之后再返回到細胞核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄沉默。第二條途徑是次要途徑，成熟的pre-piRNAs結(jié)合AUB形成AUB-pre-piRNAs復(fù)合物（圖1）。

圖1 piRNAs的作用途徑Fig. 1 piRNAs biogenesis pathways

AUB-pre-piRNAs是一個可以識別目標mRNA的復(fù)合物，介導(dǎo)mRNA降解，在mRNA的切割過程中形成一個次生piRNAs。piRNAs成熟之后與AGO結(jié)合，形成更多與原染色體序列相似的piRNAs。由此往復(fù)循環(huán)，開始次級piRNAs生物發(fā)生途徑的擴增（圖2）。

圖2 次級piRNAs生物發(fā)生途徑Fig. 2 The secondary processing pathway of piRNAs biogenesis

成熟的piRNAs的加工過程包括piRNA前體（pre-piRNA）的產(chǎn)生、5’端和3’端的修飾、核苷酸的甲基化以及成熟piRNAs的產(chǎn)生[16]。piRNAs在動物性腺中的轉(zhuǎn)錄主要在異染色質(zhì)上的piRNA基因簇中被激活。如果蠅的 piRNA 簇包括啟動子元件、RNA 聚合酶 II 和下游組件，其啟動子區(qū)域具有 H3K4me2 二甲基化[17]。RNA聚合酶II和其他轉(zhuǎn)錄因子開始進行預(yù)啟動，可啟動piRNAs轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶在異染色質(zhì)DNA模板的3’到5’方向移動，催化piRNAs鏈的延伸，最終pre-piRNAs生成。Yb體通常位于線粒體周圍，pre-piRNAs與生殖質(zhì)中的細胞質(zhì)的Yb體結(jié)合，可以增強PIWI和piRNAs的裝配能力[18-20]。

總體而言，piRNAs可維持基因的完整性、穩(wěn)定性，參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄與翻譯，所以當piRNAs沉默復(fù)合體原件失控可能會影響基因的正常轉(zhuǎn)錄與翻譯，造成基因突變，是腫瘤產(chǎn)生的重要條件[21]。piRNAs生物合成的途徑是一個復(fù)雜的過程，現(xiàn)在很多現(xiàn)有的研究調(diào)查都是從生殖細胞研究中所獲得，機制尚未完全闡明，許多piRNAs的通路特征尚不清楚[22]。

2 piRNAs在胃癌中的表達

研究顯示，piRNAs作為一類新型非編碼小RNA，與microRNAs功能類似，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)基因沉默及調(diào)節(jié)腫瘤進展。一些研究發(fā)現(xiàn)piRNA與胃癌的惡性程度密切相關(guān)[23]?；蛲蛔兛蓪?dǎo)致 piRNAs途徑中的DNA損傷和端粒長度變化，促進腫瘤的發(fā)生[24]。Cheng等[25]研究表明，piRNAs水平的正?；軌蛞种莆赴┘毎纳L，piR_823的模擬物在體內(nèi)體外均表現(xiàn)出對胃癌細胞生長有抑制作用，在胃癌組織的表達會有所下調(diào)；而PiR_651在胃癌患者的外周血中呈現(xiàn)高表達。這些piRNAs因子均具有開發(fā)成胃癌標志物的潛力。這可能是因為piRNAs 簇中富含轉(zhuǎn)座子片段，協(xié)助 piRNAs對轉(zhuǎn)座子的識別與結(jié)合，進而沉默轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致癌癥細胞中 piRNAs 簇中piRNA因子的異常表達更活躍。Martinez 等[26]在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，一半（256/312）piRNAs 處于過表達狀態(tài)，并進一步指出大多數(shù) piRNAs 均嵌入蛋白編碼序列，而非已知的 piRNA 簇。Cui等[27]在為胃癌患者外周血的研究中發(fā)現(xiàn)低表達的 piR-823 與腫瘤的浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Wang 等[28]報道胃癌中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4 均處于過表達狀態(tài)，但也有研究認為胃癌組織中PIWI蛋白的表達與癌旁組織的表達差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義[29,30]。

3 piRNAs在胃癌發(fā)病機制中的作用

當胃癌發(fā)生時，會發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)的基因發(fā)生了遺傳變異，進而影響腫瘤的進展。在研究胃癌易感性的多項研究中， piRNAs與全基因組的單核苷酸多態(tài)性相關(guān)[31]。根據(jù)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）的基因型數(shù)據(jù)搜索位于SMADs結(jié)合位點的SNP，從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載了胃腺癌的3級人類甲基化450和2級SNP陣列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有結(jié)合位點SNPs與胃癌的生存與風險相關(guān)。SNP rs9911630與GC風險之間的關(guān)聯(lián)，在不一樣的浸潤深度，遠處轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期的亞組中未觀察到明顯的風險作用[32]。在已發(fā)表的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）和GC的全基因組/外顯子組測序研究時，發(fā)現(xiàn)有三個變體MUC1的rs4072037，PRKAA1的rs13361707和PSCA的rs2294008與GC關(guān)聯(lián)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但是，這些SNP-GC關(guān)聯(lián)的潛在機制仍不清楚[33-35]。Christian通過分析GC相關(guān)的piRNAs是否可能介導(dǎo)SNP-GC的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，鑒定表型特異性遺傳易感基因座可以增進對GC不同亞型的了解，這對于早期檢測，診斷和治療該惡性腫瘤很重要[36]。插入缺失多態(tài)性也存在對piRNAs的潛在影響，發(fā)現(xiàn)一些非編碼轉(zhuǎn)錄和其他染色質(zhì)介導(dǎo)的調(diào)節(jié)位點也降低了插入缺失率。這些數(shù)據(jù)的整體插入缺失率比單核苷酸多態(tài)性（SNP）率低約2倍[37]。Zhang等[38]研究揭示，piRNAs片段的改變會對胃的正常功能產(chǎn)生嚴重的影響。因此，他們認為piRNAs的研究是有助于更好的理解癌癥與分子之間聯(lián)系的一個新興領(lǐng)域。

4 piRNAs在胃癌中的檢測

piRNAs的表達在腫瘤組織中整體上調(diào)，表明其發(fā)揮致癌基因的作用[38]。目前，高通量測序被用于揭示多種癌癥中的新型piRNAs和已知的同工型類型，但有必要進一步研究以更好地了解piRNAs途徑所涉及的功能和機制特征。例如，可以進行體外和體內(nèi)功能測定以研究piRNAs如何調(diào)節(jié)基因并干擾其功能。piRNAs和其他表觀遺傳分子（例如，miRNAs或其他參與染色質(zhì)重塑的蛋白質(zhì)）之間的潛在相互作用也可以在計算機和蛋白質(zhì)免疫沉淀測序分析中進行探索。同時，可以進行計算機功能富集和表達定量特征基因座（eQTL）分析，以探索基因-piRNA相互作用以及非編碼RNA與靶基因之間的相互作用。此外，也可以通過免疫共沉淀測序的方法，即抗原和抗體通過高通量測序與靶RNA特異性結(jié)合分析幫助發(fā)現(xiàn)piRNAs的調(diào)控靶標[39]。單細胞測序（scRNA-seq）也是探究piRNAs比較前沿的一項測序技術(shù)。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是應(yīng)用最廣泛的單細胞測序方法，也是目前最熱門的測序方法。它可以從單個細胞中提取，逆轉(zhuǎn)錄，擴增和測序所有RNA，然后分析測序結(jié)果以研究piRNAs的作用。在精準醫(yī)療時代，研究piRNAs參與胃癌進程的表觀遺傳機制，對深入了解癌癥的發(fā)生，開發(fā)新的抗癌方法顯得至關(guān)重要[40]。

5 小結(jié)與展望

胃癌是目前影響世界公共健康的一個重要問題，胃癌的病因很復(fù)雜，并且仍然是研究的熱點問題，除了環(huán)境問題、遺傳因素、感染因素之外，在疾病的進程遺傳學(xué)也中起著重要作用。因此，對piRNAs的遺傳學(xué)機制的探索，對于幫助臨床盡早的提供疾病的治療的方法至關(guān)重要。本文中，我們闡明piRNAs長度在正常組織與腫瘤組織中存在差異。piRNAs序列中存在INDEL多態(tài)性可以解釋這種現(xiàn)象，這可能會干擾piRNA的功能，從而導(dǎo)致piRNAs介導(dǎo)的調(diào)控被破壞。因此，考慮到遺傳變異在癌癥研究中的相關(guān)性以及piRNAs基因中遺傳變異的證據(jù)，研究piRNAs多態(tài)性的影響非常重要?？梢酝ㄟ^基因組分析（例如DNA測序）來識別這些變體，并可以進行生物信息學(xué)分析以評估功能改變。這些研究可能有助于闡明可能與致癌作用有關(guān)的piRNAs的機制特征。此外，如先前報道，與癌癥進展相關(guān)的piRNAs可以在患者的血液中循環(huán)代謝，但并未描述piRNAs如何循環(huán)代謝。這一點很重要，因為循環(huán)生物標志物因具有較低的侵入性而被優(yōu)先使用。未來可以通過一種轉(zhuǎn)化方法，開發(fā)通過qPCR分析評估piRNAs拷貝數(shù)和相對表達的驗證研究，且將這些研究結(jié)果納入醫(yī)學(xué)常規(guī)檢查。還需要強調(diào)一點，目前尚無正在進行或已發(fā)表的涉及piRNAs的臨床試驗。因此，鑒于piRNAs分子可用于臨床實踐（如篩查，診斷和治療）的新型疾病生物標志物和/或抗癌治療靶標的前景，進一步研究其參與胃癌相關(guān)途徑至關(guān)重要。