HPLC法測(cè)定沙棘雨生紅球藻膠囊中異鼠李素的含量

李冬冬，陳笑宇，吳香婷，趙詩(shī)聰，朱日，劉英鏈，楊錦竹※，金向群※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林省正和藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，吉林 通化 134001）

氧化還原平衡是人體健康的基礎(chǔ)，也謂本。隨著人們生活壓力的增大以及受各種外界環(huán)境的影響，人體會(huì)產(chǎn)生自由基堆積，其引起的氧化脅迫可引起一系列如衰老、腫瘤、自身免疫性疾病以及一些慢性退行性疾病等，因此從失衡損傷源頭切入，及時(shí)補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)幫助自身達(dá)到氧化還原平衡是十分必要的。

沙棘雨生紅球藻膠囊是由沙棘、雨生紅球藻粉以及玉米淀粉等輔料制成的具有抗氧化功能的保健食品。在2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中記載，沙棘為胡頹子科植物沙棘（Hippophae rhamnoides L.）的干燥成熟果實(shí)[1]，性溫，味微酸，歸脾、胃、肺、心經(jīng)，為蒙古族、藏族常用藥材，現(xiàn)作為一種藥食同源的植物被廣受關(guān)注。沙棘果實(shí)中含有多種生理活性物質(zhì)，如黃酮類、多酚類、油脂、多種維生素和微量元素等[2]，具有健胃消食[3]、止咳祛痰[4]、抗炎鎮(zhèn)痛[5]、降血脂[6]、抗疲勞[5]和抗氧化[7-9]等功效。

沙棘中含有豐富的以異鼠李素、槲皮素和山柰酚為母核的黃酮類化合物，研究表明，沙棘黃酮具有清除人體內(nèi)自由基和阻斷過(guò)氧化作用[10]，并能使SOD的活性提高[11]，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生，保護(hù)并促進(jìn)細(xì)胞的健康生長(zhǎng)[12]，被視為是一種良好的活性氧清除劑。沙棘黃酮中以異鼠李素的含量最為豐富[13]，有相關(guān)研究[14-18]也報(bào)道了關(guān)于異鼠李素的含量測(cè)定方法，將異鼠李素作為沙棘質(zhì)量控制的標(biāo)志性成分。本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜法（HPLC）建立沙棘雨生紅球藻膠囊中異鼠李素含量的測(cè)定方法，該法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單易行且分離度高，可為沙棘雨生紅球藻膠囊的開發(fā)和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)I109591），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；沙棘雨生紅球藻膠囊為實(shí)驗(yàn)室自制；甲醇、磷酸為色譜純（美國(guó)Fisher試劑公司）；乙醇、鹽酸為分析純（吉林省金泰化玻有限公司）。

1.2 儀器

Acchrom S3000高效液相色譜儀（華普科技有限公司）；Sartorius BT 25S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HH-Z數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.3 溶液的配制

1.3.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱定異鼠李素，適量甲醇溶解并定容至刻度線，以此配制成濃度為14.6g/mL的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液的配制 取沙棘雨生紅球藻膠囊內(nèi)容物適量，在研缽中研細(xì)，精密稱取約2 g，置于具塞燒瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定，用95%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)取續(xù)濾液25 mL，加入鹽酸3.5 mL，75℃水浴1 h，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加入適量95%乙醇并定容至刻度線，搖勻?yàn)V過(guò)即得[1]。

1.3.3 缺沙棘陰性對(duì)照液的配制 取缺沙棘陰性樣品適量，按“1.3.2”所述方法進(jìn)行處理，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：Inert Sustain Swift-C18柱（4.6 mm 250 mm，5m）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（56:44）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10L。

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 專屬性考察

將“1.3”項(xiàng)下異鼠李素對(duì)照品溶液、沙棘雨生紅球藻膠囊供試品溶液和沙棘陰性對(duì)照液3種溶液，注入HPLC儀器中進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。本方法專屬性良好，17 min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，且供試品中目標(biāo)峰與相鄰峰達(dá)到基線分離，無(wú)雜峰的影響；陰性對(duì)照液在該保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，符合要求。

圖1 沙棘雨生紅球藻膠囊高效液相色圖譜Fig.1 HPLC of Shaji Haematococcus pluvialis capsules

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL和8 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至相應(yīng)刻度，搖勻，得到濃度分別為0.004 38 mg/mL、0.005 84 mg/mL、0.007 30 mg/mL、0.008 76 mg/mL、0.010 22 mg/mL和0.011 68 mg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，進(jìn)樣測(cè)定，數(shù)據(jù)見表1。以峰面積為縱坐標(biāo)，異鼠李素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。異鼠李素的質(zhì)量濃度在0.004 38 mg/mL到0.011 68 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=29 510.765x+34.115，R2=0.999 4。

圖2 異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of isorhamnetin

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the linear

2.3 精密度考察

將“1.3.1”項(xiàng)下異鼠李素對(duì)照品溶液稀釋后，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次精密吸取10L，結(jié)果求得峰面積的RSD=0.72%＜2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性考察

取沙棘雨生紅球藻膠囊的內(nèi)容物，按“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣體積為10L，計(jì)算含量，供試品中所含的異鼠李素質(zhì)量濃度的RSD值為0.52%＜2%（n=6），本法重復(fù)性良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性考察

吸取同一份供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h時(shí)注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到在24 h內(nèi)異鼠李素峰面積的RSD為0.68%＜2%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定已知異鼠李素含量的沙棘雨生紅球藻膠囊內(nèi)容物粉末6份，各1.0 g，再加入等量的異鼠李素對(duì)照品，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定并分析，計(jì)算各樣品中異鼠李素的回收率，見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery results

2.7 樣品測(cè)定

從3個(gè)批次不同的沙棘雨生紅球藻膠囊中各取3個(gè)平行樣，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行供試品處理，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到異鼠李素的含量均值分別為45.41 mg/100 g、44.72 mg/100 g和45.66 mg/100 g，9個(gè)樣品的RSD=0.73%＜2%，說(shuō)明此方法可用于測(cè)量異鼠李素的含量，且較為準(zhǔn)確、可靠。

3 討論與結(jié)果

3.1 討論

本試驗(yàn)曾將沙棘雨生紅球藻膠囊內(nèi)容物經(jīng)乙醇提取后不進(jìn)行酸水解處理，測(cè)得的異鼠李素含量遠(yuǎn)低于酸水解組，因此，本產(chǎn)品中的異鼠李素主要以苷的形式存在，進(jìn)行酸處理能夠使苷充分水解轉(zhuǎn)化為苷元[19]，使得測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確；參照藥典的流動(dòng)相條件甲醇-0.4%磷酸溶液（58:42）[1]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)異鼠李素分離度較差，與相鄰峰未達(dá)到基線分離，于是將流動(dòng)相的極性比例微調(diào)，調(diào)整至甲醇-0.4%磷酸溶液為（56:44），延長(zhǎng)了異鼠李素的保留時(shí)間，并將進(jìn)樣體積由20L 降低至10L，最終使異鼠李素的分離度大大改善，有效避免了雜峰的影響。

3.2 結(jié)果

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）建立了沙棘雨生紅球藻膠囊中異鼠李素含量的測(cè)定方法并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)考察，異鼠李素在0.004 38 mg/mL～0.011 68 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為y=29510.765x+34.115，R2=0.999 4；方法學(xué)考察結(jié)果良好，回收率在96.43%～98.98%范圍內(nèi)，平均加樣回收率值為97.42%，RSD=0.89%（n=6）。另外，此分析方法得到的異鼠李素色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱，保證了定量的準(zhǔn)確性。綜上可知，該方法可用于沙棘雨生紅球藻膠囊中異鼠李素的含量測(cè)定，可為其后續(xù)的開發(fā)和研究提供參考。