吳婷,劉思師,陳仲巍,曾穎,陳建福,陳雅欣,何若男1,※
(1.廈門醫(yī)學(xué)院,天然化妝品福建省高校工程研究中心,福建 廈門 361023;2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,福建 廈門 361023;3.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院,福建 漳州 363000)
黑蒜又稱為“發(fā)酵大蒜”,通常是以完整帶皮大蒜或大蒜新鮮碎顆粒為原材料,置于60~80℃、相對(duì)濕度70%~90%的高溫高濕環(huán)境下長時(shí)間發(fā)酵所得,該過程經(jīng)美拉德反應(yīng)形成類黑精等物質(zhì),使得大蒜逐步褐變。發(fā)酵醇熟后的黑蒜,在保留大蒜原有生物活性物質(zhì)的同時(shí),其氨基酸、類黑精、有機(jī)酸、多酚、含硫化合物和還原糖含量均有顯著增加,具有抗菌消炎、降血脂、增強(qiáng)免疫、降血糖[1]、保肝、抗腫瘤和保護(hù)心臟的生物活性[2],同時(shí)還祛除了大蒜的辛辣口感,甜度增加,酸甜可口。因此,黑蒜作為一種新興的保健食品逐漸受到人們的喜愛,具有良好的市場前景。
本就作為食品多酚一項(xiàng)重要來源的大蒜,在發(fā)酵后其多酚含量增加數(shù)倍[3],強(qiáng)還原力成為黑蒜最突出的特點(diǎn)。黑蒜的主要多酚類物質(zhì)包括類黃酮、酚酸以及單寧,在其發(fā)酵加工過程中,多酚類物質(zhì)在高溫高濕條件下被加熱水解為眾多酚類小分子物質(zhì),由此被釋放出的大量酚羥基大大提高了黑蒜的抗氧化性。Lu[4]等研究發(fā)現(xiàn)黑蒜比未加工的大蒜總酚含量高出7~11倍,總酚酸含量高出4~8倍,總黃酮含量高出1~5倍。王衛(wèi)東等[5]報(bào)道黑蒜清除自由基的能力高出大蒜2倍,總還原能力高出大蒜的9倍。王首人等[6]發(fā)現(xiàn)在體外抗氧化活性方面,黑蒜比常規(guī)蒜高出9倍余。強(qiáng)倩等[7]報(bào)道黑蒜的還原能力與多酚含量呈正相關(guān)。LEE等[8]以數(shù)組糖尿病小鼠(3周齡)為樣本,7周內(nèi)分別飼喂添加常規(guī)凍干大蒜和常規(guī)凍干黑蒜的飼料,發(fā)現(xiàn)飼喂黑蒜的樣本谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶以及超氧化物歧化酶活性升高顯著,黑蒜還原力強(qiáng)于常規(guī)大蒜4倍以上,結(jié)合其體外還原性測定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)一致表明黑蒜具有較強(qiáng)的抗氧化性。
微波輔助萃取是近年發(fā)展推廣的一種新型技術(shù),此法結(jié)合微波這一非電離的電磁輻射力和超聲波由劇烈機(jī)械效應(yīng)和沖擊波對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的空化作用力,在破壞樣品的氫鍵及分子間作用力的同時(shí)提高傳質(zhì)速率[9,10],能夠以低廉成本快速提取產(chǎn)物。此外,微波輔助萃取方式也有助于樣品的溶質(zhì)溶液在均勻受熱狀態(tài)下短時(shí)高效浸出細(xì)胞內(nèi)容物,其與傳統(tǒng)提取方法超聲波法相輔相成可大幅提高提取效率,在性質(zhì)不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物提取方面優(yōu)勢尤為明顯[11]。此外,該法不存在傳統(tǒng)熱水浸提法低效率、易糊化及高耗能的缺點(diǎn),相比于浸提法和回流提取法對(duì)環(huán)境無污染更高效,相比于酶法成本大幅降低,同時(shí)避免了酶易失活的缺點(diǎn)。本研究采用微波 超聲波協(xié)同提取方式,探索各因素對(duì)黑蒜果肉總多酚提得率的影響,以響應(yīng)面法探索確定最佳條件,并對(duì)比鮮蒜進(jìn)行抗氧化活性對(duì)比研究,為黑蒜果肉的資源開發(fā)研究提供參考和理論支持。
獨(dú)頭黑蒜(由山東軒逸食品有限公司提供,產(chǎn)自山東省濟(jì)寧市金山縣);大蒜(產(chǎn)自山東省濟(jì)寧市);沒食子酸、福林酚(北京索萊寶科技有限公司);DPPH自由基[分析純,1,1-二苯基-2-苦肼基自由基,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司];鄰苯三酚(西隴化工股份有限公司);Tris(北京索萊寶科技有限公司);水楊酸(分析純);氫氧化鈉(分析純);L(+)-抗壞血酸(分析純,北京索萊寶科技有限公司A8100)。
粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司XL-10B);電子分析天平(sartorius BSA2202S-CW);微波超聲波萃取儀(Xinyi-2A升級(jí)款);臺(tái)式高速離心機(jī)[Sigma離心機(jī)(揚(yáng)州)有限公司3K15];酶標(biāo)儀(BioTek EPOCH/2);超低溫保存箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司DW-25L262);pH計(jì)(EUTECH pH700)。
1.2.1 黑蒜粉的制備 將去皮后的獨(dú)頭黑蒜切成薄片狀,置于電熱鼓風(fēng)干燥箱,65℃條件下烘干至恒重后,放入萬能粉碎機(jī)粉碎并過180m(80目)篩,所得干物質(zhì)放置于干燥器內(nèi)避光密閉保存。
1.2.2 黑蒜多酚類物質(zhì)提取方法 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,稱取經(jīng)預(yù)處理的黑蒜果肉粉末(1.00±0.05)g共3份分別放置于3個(gè)50 mL的錐形瓶內(nèi),常溫條件下(20℃)加入相應(yīng)料液比的提取溶劑,采用超聲波-微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng)(恒定70℃)萃取,萃取后經(jīng)5 000 r/min旋轉(zhuǎn)離心5 min分離留取上清液,以福林 酚比色法測定黑蒜多酚類物質(zhì)含量。
1.2.3 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及黑蒜果肉總酚含量測定 參考劉皓涵等[12]的方法,選用福林 酚比色法,略做修改。以0.2 mL為間隔等梯度取樣新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 mg/L的沒食子酸溶液)0~1.4 mL,測定吸光度值,以此繪制該標(biāo)準(zhǔn)曲線。以相同方法,精確移取適量的黑蒜萃取樣品液,測定記錄其吸光度后帶入標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算得黑蒜萃取樣品溶液的總酚物質(zhì)含量m。
上式中A為所測黑蒜樣液吸光度值;0.003 5為空白吸光度值;v為樣液體積,mL;d為樣液稀釋倍數(shù);0.064 5為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
1.2.4 黑蒜總酚超聲波 微波協(xié)同萃取單因素實(shí)驗(yàn)參考1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法,分別在時(shí)間12 min,乙醇體積濃度(以下簡稱乙醇濃度)60%,溫度70℃[6],超聲功率和微波功率均200 W條件下,設(shè)置5個(gè)液料比(乙醇/黑蒜果肉粉,mL/g)水平(0、20、30、40、50);在液料比30:1,溫度70℃,乙醇濃度60%,超聲功率和微波功率均200 W條件下,設(shè)置5個(gè)提取時(shí)間(min)水平(6、8、10、12、14);在液料比30:1、溫度70℃、乙醇濃度60%、時(shí)間12 min、超聲功率和微波功率均200 W條件下,設(shè)置5個(gè)乙醇濃度(%)水平(40、50、60、70、80);在液料比30:1、溫度70℃、乙醇濃度60%、時(shí)間12 min和微波功率200 W條件下,設(shè)置5個(gè)超聲功率(W)水平(100、200、300、400、500);在液料比30:1、溫度70℃、乙醇濃度60%、時(shí)間12 min和超聲功率200 W條件下,設(shè)置5個(gè)微波功率(W)水平(100、200、300、400、500)。3次重復(fù),考察對(duì)黑蒜多酚提取量的影響。
1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對(duì)黑蒜果肉總多酚提取有顯著影響的微波功率、液料比、時(shí)間和提取液濃度4個(gè)因素,以黑蒜果肉總酚提得率為響應(yīng)值來進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),其水平編碼及試驗(yàn)因素見表1。
表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology
1.2.6 黑蒜體外抗氧化能力的測定 稱取等量的黑蒜和鮮蒜,按照同樣的方式進(jìn)行總酚提取,并進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尩玫酱郎y黑蒜和鮮蒜樣品。
1.2.6.1 黑蒜提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力 參照song等[13]的方案略作改動(dòng),將精準(zhǔn)配制的一系列濃度梯度新鮮大蒜、黑蒜的樣液裝入試管,取等量當(dāng)日新鮮配制的DPPH溶液(0.2 mol/L)于暗處混合均勻,立即測定其在517 nm波長處的吸光值得A1,25℃避光恒溫反應(yīng)40 min后測定得A0,對(duì)照組替換鮮蒜黑蒜樣液為去離子水得A2。以K1(%)表示DPPH清除率。
1.2.6.2 黑蒜提取液對(duì)羥自由基的清除能力 參考劉皓涵等[12]的方案略作改動(dòng),將精準(zhǔn)配置的一系列濃度黑蒜和鮮蒜提取液分別與等量1.76 mM的FeSO4(新鮮配置)、等量1.76 mM水楊酸 乙醇(其以50%乙醇為溶劑)混合均勻,隨后加入等量1.76 mM的H2O2啟動(dòng)反應(yīng),37℃避光恒溫反應(yīng)30 min后,測定其于510 nm波長處的吸光值A(chǔ)'1。以鮮蒜/黑蒜樣液與3倍體積乙醇混合測吸光值得A'0,以蒸餾水替代鮮蒜/黑蒜樣液為空白對(duì)照A'2。以K2(%)表示羥自由基清除率。
1.2.6.3 黑蒜提取液對(duì)超氧陰離子的清除能力 參照左麗麗等[14]的方案略作改動(dòng),取25℃預(yù)熱的Tris-HCl(pH 8.2,50 mM)4.8 mL與鮮蒜/黑蒜的梯度樣液1 mL,以及2.5 mM的鄰苯三酚-HCl溶液0.4 mL(提前25℃預(yù)熱,以10 mM的HCl配制)混合,25℃恒溫反應(yīng)4min后滴加數(shù)滴8 M的HCl以終止反應(yīng),在320 nm波長處測得吸光值A(chǔ)''1,鄰苯三酚-HCl溶液替換為無水乙醇得A''0,蒸餾水替換鮮蒜/黑蒜樣液為對(duì)照A''2。以K3(%)表示超氧陰離子清除率。
2.1.1 微波功率對(duì)黑蒜總多酚提得量的影響 由圖1看出,隨著微波功率增加,黑蒜果肉總多酚的提得率在微波功率達(dá)到300 W時(shí)出現(xiàn)峰值,為6.65 mg/g,隨后劇烈下降。這是由于微波破壞影響了部分氫鍵和分子間作用力,而隨著它進(jìn)一步增強(qiáng),會(huì)使得一些多酚物質(zhì)被同步破壞[15]、提取溶劑揮發(fā),進(jìn)而致使提得量下降。因此,最適微波功率以300 W為宜。
圖1 微波功率對(duì)黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.1 Effects of microwave power on the extraction of polyphenols from black garlic
2.1.2 液料比對(duì)黑蒜總多酚提得量的影響 由圖2看出,隨著液料比的增加,黑蒜果肉總多酚的提得量有著早期迅速增高后期緩慢降低的趨勢,這是由于溶劑分子愈多,超聲波作用下傳質(zhì)動(dòng)力愈大,有助于多酚類物質(zhì)的溶解浸出[16]。當(dāng)液料比為40:1(mL/g)時(shí),其提得量最高可達(dá)7.3 mg/g。當(dāng)液料比超過40:1(mL/g)時(shí),或許因其他溶解物的競爭性抑制致使提得率減少。故黑蒜多酚最適液料比以40:1(mL/g)為宜。
圖2液料比對(duì)黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratio of polyphenols from black garlic
2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑蒜總多酚提得量的影響 由圖3看出隨著時(shí)間的增加,黑蒜果肉總多酚的提得量在協(xié)同萃取時(shí)間為11 min時(shí)達(dá)到峰值,最高達(dá)6.64 mg/g。其原理與2.1.1與2.1.5部分類似,當(dāng)空化作用和微波輻射過強(qiáng)時(shí),多酚類物質(zhì)被破壞。
圖3 時(shí)間對(duì)黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction of polyphenols from black garlic
2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑蒜總多酚提得量的影響 由圖4看出隨著時(shí)間的增加,黑蒜果肉總多酚的提得量早期先顯著增高,或因溶質(zhì)分子有助于其他溶質(zhì)分子的溶出,進(jìn)而有利于黑蒜果肉多酚類物質(zhì)的浸出[17],乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),其最高提得量達(dá)6.62 mg/g。
圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.4 Effects of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from black garlic
2.1.5 超聲功率對(duì)黑蒜總多酚提得量的影響 隨著超聲功率的增高,黑蒜總多酚的提得率呈現(xiàn)出了初期上升后期下降的趨勢,或因超聲波的機(jī)械和空化作用力破壞了黑蒜果實(shí)的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜、細(xì)胞間質(zhì),促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)迅速溶出,當(dāng)其超出200 W時(shí),過強(qiáng)的作用力又促使酚類物質(zhì)更多地發(fā)生聚合、氧化反應(yīng)[15],同步破壞了黑蒜果肉多酚類物質(zhì)——諸如鄰二酚羥基等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[18],降低了提得率。綜合實(shí)際效果與提取成本,選取超聲功率200 W為該提取液的最佳條件,其最高提得量達(dá)6.33 mg/g。
圖5 超聲波功率對(duì)黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from black garlic
2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)際結(jié)果和提取成本,將影響最小的超聲功率固定設(shè)置為200 W,固定提取溫度70℃,選用料液比、微波功率、時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量,以黑蒜總多酚提得量(率)為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案和結(jié)果分析見表2。采用Design-Expert 12.0軟件對(duì)表2進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析,獲得黑蒜總多酚提得率為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為:Y=8.43+0.276 6A+0.359 0B+0.535 9C+0.539 0D-0.019 7AB-0.009 9AC-0.033 8AD+0.022 9BC+0.070 3BD-0.065 5CD-0.866 8A2-0.700 1B2-1.03C2-0.839 9D2,由此可知二次項(xiàng)系數(shù)皆為負(fù)數(shù),拋物線開口朝下,擁有極大值點(diǎn)。方差分析結(jié)果見表3:模型回歸為極顯著(P<0.000 1),失擬項(xiàng)為不顯著(P>0.05),表明外界其余因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾不顯著。模型的決定系數(shù)為R2=0.983 4,表明回歸方程與實(shí)際測試所得數(shù)據(jù)能夠良好吻合,可以良好反映出黑蒜果肉多酚提得量與液料比、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)與時(shí)間的關(guān)系。同時(shí)可知,各因素對(duì)萃得率的影響大小為:D>C>B>A,且一次項(xiàng)(A、B、C、D)和二次項(xiàng)(A2、B2、C2、D2)對(duì)萃得率有極顯著影響(即P<0.01);交互項(xiàng)BD萃得率有顯著影響(即P<0.05),交互項(xiàng)CD對(duì)萃得率有較顯著影響。
表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 experimental designs and results of Box-Behnken
表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of the regression model
2.2.2 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)2.2.1中回歸方程制作的黑蒜多酚提取模型響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖見圖6和圖7。圖6和圖7分別反映了4個(gè)因素(液料比、微波功率、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù))兩兩交互作用下對(duì)響應(yīng)值的影響,等高線形似圓形坡度平緩表明兩因素之間交互作用不明顯,形似橢圓形坡度陡峭、排列緊密則表示二因素之間的交互作用明顯[19]。其中,料液比和微波功率之間交互作用較明顯。由圖6與圖7可得,乙醇體積分?jǐn)?shù)和萃取微波功率、時(shí)間和料液比為0水平時(shí),隨著各水平因素的變化黑蒜多酚提得量呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。由等高線圖可知,料液比與萃取時(shí)間、料液比與微波功率的響應(yīng)面相對(duì)更為陡峭,同時(shí)等高線狀似橢圓,說明二者間的交互作用較為強(qiáng)烈[19],與黑蒜總多酚萃得率的影響極顯著;乙醇體積分?jǐn)?shù)與萃取時(shí)間的響應(yīng)面最為平緩,等高線也形狀最近似圓形,說明交互作用相對(duì)較小。此結(jié)論與表3所示結(jié)果一致。
圖6 三維面圖和等高線圖Fig.6 The three-dimensional surface diagram and contour diagram
圖7 三維面圖和等高線圖Fig.7 The three-dimensional surface diagram and contour diagram
2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)優(yōu)化后的黑蒜多酚提取方程求解,得出試驗(yàn)分為內(nèi)最佳條件:乙醇水平分?jǐn)?shù)51.485%、微波功率327.457 W、萃取時(shí)間為11.759 min、液料比43.2:1(mL/g);實(shí)際試驗(yàn)條件下最佳提取工藝為:乙醇水平分?jǐn)?shù)5 1.5%、微波功率3 3 0 W、萃取時(shí)間為12 mi n、液料比43:1(mL/g)。重復(fù)3次試驗(yàn),黑蒜多酚平均提得量為8.66 mg/g,與預(yù)測值基本擬合,表明該優(yōu)化模型可靠。
2.3.1 DPPH自由基清除能力 如圖8所示,黑蒜和鮮蒜兩種蒜樣品均具備DPPH自由基清除能力,且其清除力強(qiáng)弱與提取液濃度呈顯著正相關(guān)。其中黑蒜樣品的上升幅度更為明顯,在相同樣品濃度下,黑蒜提取液的體外DPPH自由基清除能力最高可達(dá)鮮蒜近十倍。在總酚質(zhì)量濃度均為4g/mL時(shí),黑蒜的總酚提取物體外對(duì)羥基清除率可高達(dá)鮮蒜的5倍,分別為23.86%和4.3%。在總酚質(zhì)量濃度為12g/mL時(shí),黑蒜的總酚提取物體外對(duì)羥基清除率可高達(dá)鮮蒜的9倍余,分別為87.3%和9%。這可能與黑蒜果在高溫高濕環(huán)境下多酚類物質(zhì)被分解為更多的小分子酚類有關(guān)。
圖8 鮮大蒜與黑蒜果肉總多酚提取物對(duì)DPPH自由基清除能力對(duì)比Fig.8 The scavenging ability of fresh garlic extract and black garlic extract on DPPH free radical
2.3.2 羥基自由基清除能力 如圖9所示,羥自由基清除能力也伴隨著黑蒜和鮮大蒜樣品濃度的增加而明顯提升。在總酚質(zhì)量濃度均為60g/mL時(shí),黑蒜的總酚提取物體外對(duì)OH可高達(dá)鮮大蒜的近8倍,分別為88.2%和11.6%。這或許與黑蒜發(fā)酵過程中產(chǎn)生了部分具有強(qiáng)自由基清除能力的生物活性分子(如水溶性硒蛋白)[20],抑制了DPPH這一親水基團(tuán)造成的氧化反應(yīng)有關(guān)。
圖9 鮮大蒜與黑蒜總酚提取物對(duì)羥自由基的清除能力比較Fig.9 The scavenging ability of the fresh garlic extract and the black garlic extract on hydroxy free radical
2.3.3 超氧陰離子清除能力 如圖所示,超氧陰離子的清除力百分比也與2種蒜品提取液質(zhì)量濃度顯著呈正相關(guān)。在總酚質(zhì)量濃度均為30g/mL時(shí),黑蒜的總酚提取物體外對(duì)羥基清除率可高達(dá)鮮蒜的3倍余,分別為29%和7.3%。在總酚質(zhì)量濃度均為60g/mL時(shí),黑蒜的總酚提取物體外對(duì)羥基清除率可高達(dá)鮮蒜的2倍,分別為49%和22.3%。在質(zhì)量濃度為40g/mL附近時(shí)清除力百分比增長明顯放緩,這或許與硒元素[21]的量增加放緩有關(guān)。
圖10 鮮大蒜與黑蒜總酚提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除能力比較Fig.10 The scavenging ability of the fresh garlic extract and the black garlic extract on superoxide anion free radical
3.1 本研究采用微波 超聲波協(xié)同萃取法,以乙醇為提取溶劑探索超聲功率、微波功率、時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比5個(gè)因素作為自變量時(shí)對(duì)黑蒜果肉多酚提得率的影響,其中其影響順序?yàn)榱弦罕龋緯r(shí)間>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率。隨后采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑蒜果肉中多酚提得率,獲知最佳工藝參數(shù)為,在溫度為70℃,超聲功率200 W時(shí),微波功率330 W、液料比43:1(mL/g)、時(shí)間11.8 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)51.5%、在該條件下多酚提取率為8.66 mg/g,與預(yù)測值接近,表明此模型能夠用于黑蒜果肉多酚提取工藝優(yōu)化。
3.2 通過對(duì)黑蒜果肉和鮮大蒜中總酚提取物的體外抗氧化能力測定表明,黑蒜果的DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率以及羥自由基清除率均顯著優(yōu)于鮮大蒜,因而黑蒜更加適用于藥品與保健品的開發(fā)利用。