基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討引火湯防治放射性損傷的作用機制

周立慧，張瀅心，竇明杰，盧丹

（吉林大學藥學院，吉林 長春 130021）

放射治療（簡稱放療）是治療惡性腫瘤的方法之一，在腫瘤患者中，約有2/3的患者接受放療[1]。放射治療在殺滅腫瘤細胞的同時，所致的放射性損傷（radiation injury,RI）也在不斷增加，破環(huán)機體免疫功能，抑制骨髓造血功能，影響患者生活質(zhì)量[2]。放射性損傷的臨床癥狀集中于神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等方面，可表現(xiàn)為神疲乏力、發(fā)熱、頭痛及食欲下降等，因照射部位不同，甚至出現(xiàn)腹脹腹瀉和血便等癥狀[3]。目前，氧化損傷、細胞凋亡、炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)被認為是放射性損傷的發(fā)病機制[4]。西醫(yī)治療多采用大劑量抗生素及糖皮質(zhì)激素[5]，療效不甚理想，且毒副作用大[6]。

近年來，諸多研究證明，中醫(yī)藥在防治惡性腫瘤患者的放射性損傷方面具有獨特優(yōu)勢。引火湯（Yinhuo Decoction,YHT）又稱“傅山引火湯”，原為傅山所創(chuàng)，后傳授于陳士鐸，首載于陳士鐸《辨證奇聞 咽喉門》，原方由熟地黃、麥冬、巴戟天、茯苓和五味子組成，用于治療陰虛乳蛾[7]。根據(jù)中醫(yī)理論，化療屬熱邪[8]，放射性損傷的主要病因為機體“津血虧虛，邪熱內(nèi)生，陰虛則火旺，燥熱難耐”[9]。方中熟地黃滋腎養(yǎng)陰，大補腎水；巴戟天溫腎助陽；麥冬滋陰潤肺，清上焦之浮熱；五味子補腎中之陰，收斂上升之陽；茯苓通利水道及三焦通路，有協(xié)調(diào)上下陰陽之功效[10]。因此引火湯以清熱解毒、涼血散瘀和益氣養(yǎng)陰為主要治法，具有獨特優(yōu)勢[11]。引火湯作為臨床常用方，其療效已得到臨床廣泛驗證[12]，引火湯全方用藥精當，立意明確，通過滋陰以降虛火，引火歸元以協(xié)調(diào)陰陽，可以緩解陰虛火旺導致的諸多證候[13]。李可[12]將引火湯用于晚期腫瘤患者，服用兩劑引火湯即能消退放、化療后所導致的頭面生火、面紅目赤和口舌生瘡。胡凱文[14]常用引火湯治療不耐手術(shù)、放化療攻伐的惡性腫瘤患者，臨床頗具療效。李自全[15]用引火湯治療放射性口腔咽部炎癥41例，與對照組相比，觀察組有效率為92.68%（38/41），而對照組為70.73%（29/41）。可見，引火湯方用于防治放射性損傷臨床療效確切，但其作用機制尚無報道，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析引火湯防治放射性損傷的機制，為其用于防治放射性損傷提供更多理論支持。

1 材料與方法

1.1 YHT的活性成分篩選及靶點預測

熟地黃、巴戟天、茯苓和五味子的化學成分借助TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php） 數(shù)據(jù)庫檢索，麥冬的成分通過BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）進行檢索，保留綜合評分≥20和P＜0.5的成分。從上述來源收集的藥材成分中篩選出口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的活性成分，為YHT的活性成分。此外，結(jié)合文獻檢索補充YHT組方藥材中的有效活性成分，并結(jié)合文獻將不滿足篩選條件但公認的具有藥效的化學成分進行進一步補充，獲得候選化合物。利用Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ）獲得活性成分的SMILES結(jié)構(gòu)，并將其上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch） ，限定物種為“Homo sapiens”以置信度閾值（Probility）評估預測結(jié)果的可靠性，并設(shè)置“Probility≥0.1”為篩選條件，從而獲得與潛在活性成分相關(guān)的靶點。

1.2 RI疾病靶點的篩選

在GeneCard（shttps://www.genecards.org/）與OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org） 中搜索關(guān)鍵詞“radiation injury”查找與RI相關(guān)的靶點，合并上述數(shù)據(jù)庫的結(jié)果并進行去重。利用生物信息學與進化基因組學（Bioinformatics&Evolutionary Genomics）在線軟件作圖工具平臺Venny（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）進行映射，取YHT潛在靶點與RI相關(guān)靶點的交集，得到藥物與疾病的共同靶點。

1.3“中藥 活性成分 作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.1所收集的中藥活性成分與1.2所篩選交集靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件進行拓撲分析，構(gòu)建中藥 活性成分 作用靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.stringdb.org）中，種屬選擇“Homo sapiens”，置信度0.7，將TSV文件導入軟件Cytoscape 3.7.1分析節(jié)點信息，采用Cytoscape 3.7.1軟件插件CytoNCA對蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，篩選DC、BC、CC及EC均大于中位數(shù)的靶點，為核心靶點。

1.5 GO及KEGG通路富集分析

應用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn）進行可視化GO分析，包括生物過程（biological process,BP）、細胞組分（cellular compont,CC）、分子功能（molecular function,MF）以及KEGG通路分析。

1.6 核心活性成分與靶點的分子對接

選取度排名前5位的核心靶點與度值較高的中藥活性成分，使用基于Autodock Vina內(nèi)核在線分子對接工具CB-Dock（http://clab.labshare.cn/cb-dock/）對核心靶點和作用于這些靶點的成分進行分子對接。靶點蛋白的晶體結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb/）獲取，保存為.pdb格式，化合物的2D結(jié)構(gòu)，格式為.SDF。

2 結(jié)果

2.1 YHT活性成分及作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索，共得到Y(jié)HT活性成分423個，其中熟地黃76個、巴戟天174個、麥冬22個、茯苓21個以及五味子130個，按OB≥30%和DL≥0.18，經(jīng)篩選、剔除無靶點成分及文獻進行補充后共得到活性成分34個，其中熟地黃3個、巴戟天14個、麥冬3個、茯苓11個以及五味子5個，得到所有潛在活性成分預測靶點612個，YHT活性成分靶點排名前5的核心活性成分信息見表1，結(jié)構(gòu)式見圖1。

表1 YHT核心活性成分信息Table 1 YHT core active ingredient information

圖1 YHT核心活性成分結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of YHT core active ingredients

2.2 RI疾病靶點

通過GeneCards搜索得到5 833個，按score≥2倍中位數(shù)得到與RI有關(guān)的靶點數(shù)目為1 460個，OMIM搜索得到11個，合并去重后共得到1 462個RI疾病靶點。運用Venny圖將潛在活性成分作用靶點與RI疾病靶點合并后取交集，最終獲得248個YHT防治RI的靶點，見圖2。

圖2 YHT防治RI的交集靶點Fig.2 Intersection targets of YHTfor preventing and treating of RI

2.3 中藥 活性成分 作用靶點網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建中藥 活性成分作用靶點圖，共得到287個節(jié)點，1 058條作用關(guān)系，結(jié)果見圖3。其中活性成分以“degree”值來表示，中藥活性成分排名前5位的有五味子醇乙（Gomisin-A,degree=61）、五味子酯乙（Schizandrer B，degree=58）、五味子丙素（Wuweizisu C，degree=57）、啤酒甾醇（Cerevisterol，degree=57）和戈米辛G（Gomisin G，degree=55）。

圖3 YHT“中藥 活性成分 作用靶點”圖Fig.3 YHT diagram of"Traditional Chinese Medicines Active ingredients Action targets"

2.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將蛋白靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，將結(jié)果導入Cytoscape軟件中，利用CytoNCA分析，根據(jù)各參數(shù)中位值進行篩選，分別為DC＞11、BC＞110.161 33、CC＞0.399 67和EC＞0.026 08，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點43個，取排名前10的靶點，見表2，篩選策略見圖4。排名前5的靶點預測為核心靶點，包括SRC、HSP90AA1、STAT3、EGFR和AKT1。

圖4 核心靶點的篩選Fig.4 Screening of core targets

表2 PPI互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點Table 2 PPI interaction network core targets

2.5 GO及KEGG富集分析

GO富集分析得到1 127個條目，根據(jù)P＜0.01篩選出588條GO分析結(jié)果，分別根據(jù)靶點富集數(shù)目的多少進行排序，篩選出排名前10個結(jié)果，見圖5。包括434個BP條目，主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation）、凋亡過程的負調(diào)節(jié)（negative regulation of apoptotic process）、藥物反應（response to drug）、正向調(diào)節(jié)細胞增殖（positive regulation of cell proliferation）和肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）；53個CC條目，主要涉及等離子體膜（plasma membrane）、胞液（cytosol）、質(zhì)膜的組成部分（integral component of plasma membrane）、細胞表面（cell surface）和胞質(zhì)核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm）；101個分子功能MF條目，主要涉及蛋白結(jié)合（protein binding）、ATP結(jié)合（ATP binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、酶結(jié)合（enzyme binding）和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）。

圖5 GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis

同時，以P＜0.01作為條件進行篩選，共富集到121條KEGG通路，并篩選出靶點富集數(shù)目排名前20的結(jié)果，見圖6。將通路與成分及靶點結(jié)合起來，進行了可視化，繪制了成分 靶點 通路圖，見圖7。分析結(jié)果表明，YHT防治RI的靶點主要涉及的通路有癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K-Akt通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、粘著斑（Focal adhesion）、前列腺癌（Prostate cancer）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B）和HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）等。

圖6 KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis

圖7 YHT“成分 靶點 通路”圖Fig.7 YHT"compound target pathway"diagram

2.6 分子對接驗證

為了驗證YHT核心活性成分對其干預疾病潛在靶點作用的可能性，選取核心靶點SRC、HSP90AA1、STAT3、EGFR和AKT1與作用于核心靶點的小分子配體進行分子對接，靶點蛋白與分子的結(jié)合能力用Vina對接分數(shù)衡量，值越低，表明受體和配體親和力越高?？梢姡瑢臃謹?shù)均小于 5.0，其中啤酒甾醇（FL4）與HSP90AA1（PDB ID:3o0i），對接分數(shù)為 9.8，戈米辛G（WWZ4）與HSP90AA1（PDB ID:3o0i），對接分數(shù)為 8.8，結(jié)果見表3。

表3 核心活性成分與靶點分子對接分數(shù)Table 3 Docking fractions of core active ingredients and target molecules

通過分子模擬分析推測核心活性成分與靶點相互作用情況，見圖7。可見，化合物與靶點之間存在氫鍵-相互作用和疏水堆積等分子間結(jié)合力。啤酒甾醇與天冬酰胺-51（N51）殘基形成氫鍵，結(jié)合能力強，對穩(wěn)定小分子配體有著重要作用；戈米辛G與亮氨酸-107（L107）殘基和酪氨酸-139（Y139）形成氫鍵，與苯丙氨酸-138（F138）的苯環(huán)形成了-相互作用，其余的氨基酸殘基與化合物的疏水環(huán)形成強的相互作用，這些氫鍵及疏水作用的存在可以使化合物與靶蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合。

圖8 化合物與HSP90AA1的分子對接模擬Fig.8 Molecular docking simulation of the compound with HSP90AA1

3 討論

通過“中藥 活性成分 潛在作用靶點”分析表明，五味子醇乙、五味子酯乙、五味子丙素、啤酒甾醇和戈米辛G可能是引火湯防治放射性損傷的核心活性成分。五味子醇乙、五味子酯乙、五味子丙素和戈米辛G屬于木質(zhì)素類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌及抗纖維化等活性[16]。五味子丙素和五味子醇乙還可以通過上調(diào)巨噬細胞炎癥蛋白-1和粒細胞 巨噬細胞集落刺激因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[17]。戈米辛G通過降低Akt的磷酸化水平，抑制PI3K-Akt信號通路，抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡[18]。啤酒甾醇可降低促炎性細胞因子（如TNF-、IL-6）的表達及抑制MAPK/NF-B/AP-1通路來減輕炎癥[19]。因此，木質(zhì)素類化合物在防治放射性損傷方面的活性值得關(guān)注。

綜合分析，推測SRC、HSP90AA1、STAT3、EGFR和AKT1是引火湯防治放射性損傷的核心靶點。SRC是第一個被確認的原癌基因[20]，調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、遷移、分化和死亡。SRC抑制劑通過抑制SRC可以保護小鼠免受輻射誘導的損傷[21]，并誘導細胞周期停止來持續(xù)抑制細胞增殖，達到抗腫瘤的作用[22]。HSP90AA1是熱休克蛋白家族的分子伴侶之一，可以調(diào)節(jié)雌激素受體的活動，參與細胞凋亡，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，保持細胞穩(wěn)態(tài)[23]，同時參與調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路，調(diào)節(jié)生物修復過程的功能，提高細胞對輻射應激的耐受性，發(fā)揮抗輻射作用[24]。在各種類型的DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂是最危險的因素[25]，EGFR通過激活DNA-PKcs促進造血干細胞DNA修復和造血再生[26]。STAT3是信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，已經(jīng)證明與細胞自噬有關(guān)，通過誘導KAP1的降解，激活STAT3使BRCA1的表達上調(diào)，從而促進骨髓造血細胞修復輻射引起的DNA損傷[27]。抑制STAT3能夠減少抗凋亡蛋白的表達，導致細胞死亡，增加腫瘤的放射敏感性[28]。AKT1是AKT激酶之一，激活AKT1的突變體可使輻射后耐受性增加，提高輻射后的細胞生存率，并加速DNA修復，促進電離輻射的抵抗力[29]。上述靶點均可作為引火湯防治放射性損傷的核心作用靶點。

通過KEGG通路分析，可以看出，引火湯防治放射性損傷的作用機制是通過多通路的協(xié)同作用。引火湯防治放射性損傷的通路相關(guān)性最高的是癌癥通路、PI3K-Akt通路和HIF-1信號通路等。AKT1是PI3KAkt通路中的重要蛋白，PI3K-Akt通路在腫瘤細胞中異常激活，具有促進腫瘤細胞惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力，并且在腫瘤的化學治療耐藥和放射治療抗拒中起著非常重要的作用[30]。PI3K-Akt依賴性途徑對輻射損傷后有保護作用或促進再生，AKT途徑的失活會減少細胞增殖，使細胞的DNA修復能力下降，導致輻射誘導的細胞凋亡增加，而AKT途徑的激活則產(chǎn)生了相反的結(jié)果[31,32]。HIF-1是缺氧誘導因子，HIF-1或其下游轉(zhuǎn)錄物能夠?qū)椛湔T導的血管損傷提供保護，或促進其恢復[33]。

綜上所述，引火湯中的五味子醇乙、五味子酯乙和五味子丙素等活性成分作用于SRC、HSP90AA1和STAT3等靶點，通過調(diào)控PI3K-Akt和HIF-1等信號通路防治放射性損傷。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法初步闡述了引火湯防治放射性損傷的潛在活性成分、作用靶點和發(fā)揮藥效的關(guān)鍵生物學通路，從分子水平揭示了可能的作用機制。為以引火湯方為基本方進行放射損傷防治提供了更多理論支持，也為開發(fā)利用引火湯方提供理論依據(jù)。