淫羊藿苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷保護(hù)作用及其作用機(jī)制研究

趙建通，劉文瞻，萬(wàn)洪磊，路志民，郭明濤，王冰，肖波

（邯鄲市第一醫(yī)院泌尿外科河北 邯鄲056000）

順鉑（Cisplatin,CDDP）是一種廣泛應(yīng)用于肺、睪丸和卵巢癌等實(shí)體惡性腫瘤的臨床化療藥物，具有強(qiáng)烈的腎毒性，由CDDP誘導(dǎo)的急性腎損傷（Acute kidney injury,AKI）限制了該類(lèi)藥物的應(yīng)用[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)約有1/4的接受CDDP化療的患者出現(xiàn)了AKI癥狀[4]。淫羊藿苷（Icariin,ICA）是中草藥淫羊藿的主要活性成分之一，為8-異戊烯基黃酮苷類(lèi)化合物。ICA具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)，補(bǔ)腎壯陽(yáng)、抗衰老等功效[5,6]。在之前的研究中已經(jīng)報(bào)道了ICA對(duì)腎臟疾病的治療作用，但有關(guān)ICA對(duì)CDDP誘導(dǎo)的急性腎損傷研究仍然較少[7,8]。本研究通過(guò)建立順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型，探究淫羊藿苷對(duì)急性腎損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

40只9周SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體重（27±2）g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SYXK（浙）2021-0040。

1.2 藥品與試劑

順鉑注射液（貨號(hào):SC5170），溶于0.9%生理鹽水，購(gòu)自北京索萊寶科技公司。淫羊藿苷粉末（貨號(hào):S2312），純度＞99.05%，溶于0.9%生理鹽水，購(gòu)自Selleckchem公司；白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1,IL-1）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-（transforming growth factor-,TGF-）等酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司；磷酸化核因子（p-p65）多抗、I B多抗、-肌動(dòng)蛋白（-actin）多抗及山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購(gòu)自上海碧云天公司。

1.3 儀器

CX23光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；Synergy H4全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio Tek公司；ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 動(dòng)物模型建立及分組[7,9,10]

將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Control），淫羊藿苷組（CIA），順鉑模型組（CDDP），淫羊藿苷治療組（CDDP+CIA），每組10只。老鼠生長(zhǎng)與12/12 h的明暗周期環(huán)境中，溫度（23±1）℃，濕度50%±5%，自由采食，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。Control組腹腔注射等劑量0.9%生理鹽水，CIA組灌胃20 mg/kg淫羊藿苷，連續(xù)7 d，CDDP組一次性腹腔注射13 mg/kg CDDP。CDDP+CIA組在腹腔注射CDDP 5 d后連續(xù)灌胃20 mg/kg淫羊藿苷7 d。

1.5 血清中BUN、Scr檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束收集小鼠血液樣本。小鼠血清Scr及BUN水平用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)（南京建成），依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作[11]。

1.6 腎臟指數(shù)計(jì)算

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取小鼠腎臟稱(chēng)重，小鼠腎臟指數(shù)計(jì)算=小鼠腎臟重量/小鼠體重重量。

1.7 蘇木精 伊紅染色觀察腎臟中組織病理學(xué)變化

處死小鼠后，將小鼠腎臟浸入4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脫水，利用二甲苯對(duì)組織進(jìn)行透明處理，浸蠟包埋，切片機(jī)將組織切片（3～5m），蘇木精伊紅染色，二甲苯透明后經(jīng)樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.8 ELISA檢測(cè)腎臟中IL-1、IL-6、IL-10和TNF- 表達(dá)情況

頸椎脫臼處死小鼠，分離小鼠腎臟，PBS充分清洗后用濾紙充份吸干，取小鼠腎臟于PBS中勻漿，離心后，用ELISA試劑盒檢測(cè)肺組織IL-1、TNF-、IL-6和IL-10含量，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（OD 570 nm）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腎臟中P65和I B 蛋白水平

取液氮保存的小鼠腎臟組織，充分研磨后轉(zhuǎn)至離心管，加入RIPALysis Buffer（RIPA）及蛋白酶抑制劑（PMSF）混合（100:1）的細(xì)胞裂解液于冰上裂解。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取樣本40g按比例與上樣緩沖液混合，其他按文獻(xiàn)步驟進(jìn)行操作[12,13]，蛋白表達(dá)量以目的條帶/-肌動(dòng)蛋白（-actin）的灰度值表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析，Duncan多重檢驗(yàn)進(jìn)行分析。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值+標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重及死亡率變化

與Control組比較，淫羊藿苷（CIA）組小鼠體重?zé)o顯著差異，順鉑（CDDP）處理組小鼠體重顯著下降（P＜0.01），CDDP+CIA處理組小鼠體重顯著下降（P＜0.05）（圖1 A）。且CDDP處理組分別在第3天、第7天、第9天及第11天出現(xiàn)小鼠死亡；CDDP+CIA處理組在第5天出現(xiàn)小鼠死亡（圖1 B）。以上結(jié)果表明CDDP處理降低小鼠生長(zhǎng)性能，CIA能緩解由CDDP誘導(dǎo)的小鼠生長(zhǎng)性能下降。

圖1 小鼠體重及死亡率Fig.1 The body weight and mortality of mice

2.2 各組小鼠腎臟指數(shù)變化

與Control組比較，CIA組與CDDP+CIA處理組小鼠腎臟指數(shù)無(wú)顯著差異，CDDP組小鼠腎臟指數(shù)顯著下降（P＜0.05）（圖2 B）。且腎臟剖檢結(jié)果表明，相比Control組與CIA組，CDDP處理組小鼠腎臟被膜表面出現(xiàn)凹凸不平、缺血等現(xiàn)象，而CDDP+CIA處理組小鼠腎臟無(wú)顯著差異（圖2 A）。以上結(jié)果表明CDDP處理誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷，CIA能緩解由CDDP誘導(dǎo)的小鼠腎損傷。

圖2 小鼠腎臟指數(shù)變化Fig.2 Changes of renal index in mice

2.3 各組小鼠血清中肌酐及尿素氮水平變化

與Control組相比較，CIA組小鼠血清中Scr、BUN水平無(wú)顯著差異，CDDP組小鼠血清中Scr、BUN水平極顯著上升（P＜0.01）。與CDDP組比較，CDDP+CIA組小鼠血清中Scr、BUN水平顯著下降（P＜0.01）。以上結(jié)果表明CDDP處理降低小鼠腎功能，保護(hù)劑CIA緩解由CDDP誘導(dǎo)的小鼠腎功能損傷，見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠血清中肌酐及尿素氮水平變化Fig.3 Changes of creatinine and urea nitrogen levels in serum of mice

2.4 各組小鼠腎組織病理變化

鏡下觀察小鼠腎組織病理變化，結(jié)果表明：Control組與CIA組小鼠腎小管形態(tài)完好，腎小管細(xì)胞整齊排列正常；CDDP組可觀察到腎小管發(fā)生炎性病變，腎小管管腔內(nèi)存在大量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。CDDP+CIA組可觀察到小鼠腎小管的炎性病變減輕，表現(xiàn)為腎小管形態(tài)回歸正常，腎小管內(nèi)紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞減少。以上結(jié)果表明CDDP處理誘導(dǎo)小鼠腎臟發(fā)生病變，CIA有效緩解由CDDP誘導(dǎo)的小鼠腎臟病變，見(jiàn)圖4。

圖4 小鼠腎組織病理變化Fig.4 Pathological changes of renal tissue in mice

2.5 各組小鼠腎臟中炎性因子變化

如圖5所示，與Control組比較，CDDP組小鼠腎臟中炎性因子TNF-、IL-1和IL-6表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.01），抑炎因子IL-10表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）。與CDDP組比較，CDDP+CIA組小鼠腎臟中炎性因子TNF-、IL-1和L-6表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），抑炎因子IL-10表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）。以上結(jié)果表明CDDP處理誘導(dǎo)小鼠炎癥反應(yīng)，CIA能緩解由CDDP誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖5。

圖5小鼠腎臟中炎性因子變化Fig.5 Changes of inflammatory factors in mouse kidney

2.6 各組小鼠腎臟中NF-B信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化

如圖6所示，與Control組比較，CDDP組小鼠腎臟中核因子蛋白P65的磷酸化水平顯著升高，而P65蛋白的阻遏物I B蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.01）；與CDDP組比較，CDDP+CIA組小鼠腎臟中p-P65蛋白表達(dá)顯著下降，I B蛋白的表達(dá)量顯上升（P＜0.05）。以上結(jié)果表明CDDP處理激活小鼠體內(nèi)NF-B信號(hào)通路，CIA能抑制由CDDP激活NF-B信號(hào)通路。

圖6 小鼠腎臟中NF-B信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化Fig.6 Changes of NF-B signaling pathway protein expression in mouse kidney

3 討論

順鉑是一種臨床上廣泛應(yīng)用的化療抗腫瘤藥物，由CDDP誘導(dǎo)的急性腎損傷限制了該類(lèi)藥物的使用，而由炎性粒細(xì)胞積累產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)是CDDP產(chǎn)生急性腎損傷的主要誘因之一，因此抑制炎癥通路、減輕腎臟炎性反應(yīng)是治療該病的關(guān)鍵[14]。淫羊藿苷是中草藥淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗炎，補(bǔ)腎壯陽(yáng)作用[7,15]。本研究本研究通過(guò)建立CDDP誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型，探究ICA對(duì)急性腎損傷的保護(hù)作用。

結(jié)果表明，CDDP誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的急性腎損傷，在CDDP處理組中，小鼠死亡率增加，體重下降，血清中Scr和BUN指標(biāo)，炎性因子TNF-、IL-1和IL-6表達(dá)水平增加，NF-B信號(hào)通路被激活；而CIA處理能顯著降低由CDDP誘導(dǎo)的小鼠腎損傷，以上結(jié)果提示ICA對(duì)CDDP誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷有一定的治療作用，并且其可能是通過(guò)抑制小鼠體內(nèi)NF-B信號(hào)通路以降低小鼠炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。