響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲波協(xié)同提取黑枸杞葉多酚及抗氧化性研究

何若男，劉思師，吳婷，曾穎，陳建福，陳雅欣，陳仲巍

（1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院，天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門(mén) 361023；2.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院，藥學(xué)系，福建 廈門(mén) 361023；3.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建 漳州 363000）

枸杞葉別稱(chēng)地仙苗、天精草，自古便為我國(guó)藥食兩用植物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值居于食物前列。枸杞葉富含有多糖類(lèi)[1]、甾體類(lèi)及包括黃酮類(lèi)[2]在內(nèi)的各種酚酸類(lèi)[3]、氨基酸與精胺類(lèi)、褪黑素、甜菜堿和類(lèi)胡蘿卜素等類(lèi)型豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及資源性化學(xué)成分[4-6]。已有研究證實(shí)，枸杞葉在抑菌、神經(jīng)保護(hù)[7]、抗氧化、調(diào)血脂[8]、降血糖[9]、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫等方面展現(xiàn)生物學(xué)活性。OLATUNJI[10]發(fā)現(xiàn)枸杞葉乙酸乙酯提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來(lái)實(shí)現(xiàn)降血糖和降血脂，其中，酚酸類(lèi)作為活性功能成分能夠提升胰島素敏感性，同時(shí)抑制著由高血糖所介導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，以此緩和糖尿病致使的腎損傷[8]，并起到糖尿病的預(yù)防和治療作用。此外，枸杞葉含有的多酚類(lèi)成分也展現(xiàn)出了顯著的抗氧化活性[11]，LEE S R等[12]以高糖誘導(dǎo)炎癥并患有高脂的小鼠為樣本，對(duì)其飼喂摻雜枸杞葉的飼料后發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道上皮細(xì)胞間的緊密連接完整性得以增加，一氧化氮的產(chǎn)生減少，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激和炎癥反應(yīng)得到抑制，凸顯了其抗氧化與抗炎功效。已有研究證實(shí)，枸杞葉中黃酮類(lèi)成分的含量可超出枸杞果實(shí)近10倍[13]，黑果枸杞芽茶的總多酚、總黃酮和氨基酸含量顯著高于紅果枸杞葉茶[14]，故而，黑枸杞葉成為了當(dāng)前的一種食品新資源。時(shí)至今日，枸杞資源相關(guān)產(chǎn)業(yè)在國(guó)家戰(zhàn)略和群眾的支持下發(fā)展迅猛[15]，種植面積逐年擴(kuò)增，已逐步成為我國(guó)西北部特色支柱產(chǎn)業(yè)之一。而枸杞葉作為枸杞果藥材的副產(chǎn)物，除少部分作為枸杞芽茶市售，每年都有近百萬(wàn)噸被廢棄，造成資源浪費(fèi)。因此，對(duì)枸杞葉的資源價(jià)值進(jìn)行開(kāi)發(fā)和工業(yè)化研究，在符合我國(guó)鄉(xiāng)村振興的同時(shí)，具有良好市場(chǎng)和可持續(xù)發(fā)展前景。

微波輔助萃取作為近年發(fā)展、推廣的一種新型技術(shù)得到廣泛研究。微波以其非電離的電磁輻射作用力對(duì)樣品的氫鍵以及分子間作用力造成破壞，同時(shí)可使樣品的溶質(zhì)溶液內(nèi)外均勻受熱，助力于短時(shí)內(nèi)高效溶浸出樣品細(xì)胞的胞內(nèi)容物。超聲波作為廣泛長(zhǎng)期使用的一種傳統(tǒng)提取方法，其用于諸如多酚類(lèi)物質(zhì)的萃取時(shí)，主要由其強(qiáng)大的空化作用和振動(dòng)效應(yīng)對(duì)樣品產(chǎn)生沖擊波作用力及猛烈的機(jī)械效應(yīng)，迅速破壞細(xì)胞壁溶出胞內(nèi)物質(zhì)，以此提高傳質(zhì)速率[16]。二者結(jié)合，相輔相成下優(yōu)勢(shì)結(jié)合可將提取效率大幅提升，同時(shí)摒棄了傳統(tǒng)熱水浸提法耗時(shí)久、易糊化的缺點(diǎn)，與酶提取法相比成本也大幅降低，具有低化學(xué)試劑用量、操作簡(jiǎn)便、短時(shí)高效和成本低廉等優(yōu)勢(shì)。此外，該法尤其在性質(zhì)不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物提取中展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[17]。本研究采取微波 超聲波協(xié)同提取試驗(yàn)方式，探索各因素對(duì)黑枸杞葉總多酚萃得率的影響，并以響應(yīng)面法探索確定最佳條件，為黑枸杞葉的資源開(kāi)發(fā)再利用研究提供參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

紅枸杞葉、黑枸杞葉分別采摘自福建漳州南靖6.5年生的枸杞成樹(shù)，選取無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的新鮮葉片（由廈門(mén)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)實(shí)驗(yàn)師張娜鑒定）；沒(méi)食子酸、Tris、福林酚、L（+）-抗壞血酸（分析純）A8100（北京索萊寶科技有限公司）；DPPH自由基[分析純，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；鄰苯三酚、無(wú)水碳酸鈉、水楊酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司XL-10B）；電子分析天平（sartorius BSA2202S-CW）；微波超聲波萃取儀（Xinyi-2A升級(jí)款）；臺(tái)式高速離心機(jī)[Sigma離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司3K15]；酶標(biāo)儀（BioTek EPOCH/2）；超低溫保存箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司DW-25L262）；pH計(jì)（EUTECH pH700）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑枸杞葉粉的制備 挑選無(wú)腐爛、無(wú)蟲(chóng)害的新鮮黑枸杞葉，清洗晾干后置于65℃電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重，放入萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎并過(guò)80目（180um）篩，所得干物質(zhì)放置于干燥器內(nèi)避光密閉保存。

1.2.2 黑枸杞葉多酚類(lèi)物質(zhì)提取方法 稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的黑枸杞葉粉末（1.00±0.05）g共3份分別放置于3個(gè)微波 超聲50 mL容器內(nèi)，混合以相應(yīng)料液比的提取溶劑，采用超聲波 微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng)（恒定70℃）萃取一定時(shí)間，后經(jīng)5 000 r/min旋轉(zhuǎn)離心5min分離留取上清液，以福林 酚比色法測(cè)定黑枸杞葉多酚類(lèi)物質(zhì)含量。

1.2.3 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及黑枸杞葉總酚含量測(cè)定 參考劉皓涵等[18]的方法，采取福林 酚比色法，略加改動(dòng)。以0.2 mL為固定間隔等梯度取樣新鮮預(yù)配置的標(biāo)準(zhǔn)工作試液（100 mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液）0～1.4 mL，反應(yīng)后測(cè)定吸光度值，并以此繪制該標(biāo)準(zhǔn)曲線。同等條件下以相同方法，精確吸取適量的黑枸杞葉萃取樣品液，測(cè)定并記錄其對(duì)應(yīng)吸光度后代入以下標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算得黑枸杞葉萃取樣品溶液得總酚物質(zhì)含量m。

上式中A為所測(cè)黑枸杞葉樣液吸光度值；0.003 8為空白吸光度值；d為樣液稀釋倍數(shù)；v為樣液體積，mL；0.064 8為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.4 黑枸杞葉總酚超聲波-微波協(xié)同萃取單因素實(shí)驗(yàn) 以黑枸杞葉多酚提取率為因變量，分別以料液比、微波功率、萃取時(shí)間、超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，參考1.2.2的提取方法，獨(dú)立探究各單因素對(duì)黑枸杞葉多酚提取率的影響。

1.2.4.1 料液比對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、超聲功率和微波功率均200 W、萃取時(shí)間10 min條件下，設(shè)置5個(gè)液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平（10、15、20、25和30），平行提取3次，考察對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.2 微波功率對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、超聲功率200W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1，萃取時(shí)間10 min條件下，設(shè)置5個(gè)微波功率（W）水平（100、200、300、400和500），平行提取3次，考察對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.4 萃取時(shí)間對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、超聲功率及微波功率均200 W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1條件下，設(shè)置5個(gè)提取時(shí)間（min）水平（6、8、10、12和14）平行提取3次，考察對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、超聲功率及微波功率均200 W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1、萃取時(shí)間10 min條件下，設(shè)置5個(gè)乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）水平（40、50、60、70和80）平行提取3次，考察對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.5 超聲功率對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、微波功率200W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1，萃取時(shí)間10 min條件下，設(shè)置5個(gè)超聲功率（W）水平（100、200、300、400和500），平行提取3次，考察對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)黑枸杞葉總多酚提取有顯著影響的時(shí)間、微波功率及超聲功率3個(gè)因素，以黑枸杞葉總酚提得率為響應(yīng)值來(lái)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該試驗(yàn)水平編碼及試驗(yàn)因素見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 黑枸杞葉體外抗氧化能力的測(cè)定 稱(chēng)取等量的黑枸杞葉和紅枸杞葉，以同樣的方式分別進(jìn)行總酚提取，隨后在適當(dāng)?shù)奶荻认♂尯蟮玫酱郎y(cè)黑枸杞葉和紅枸杞葉樣品。

1.2.6.1 黑枸杞葉提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力 參照SONG等[20]的方案略作修繕，將精準(zhǔn)配制的一系列梯度濃度黑枸杞葉、紅枸杞葉的新鮮樣液分別裝入試管，取等體積當(dāng)日新鮮配置的DPPH溶液（0.2 mM）于暗處避光混合均勻，即刻測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值標(biāo)記為A1，25℃于暗處避光恒溫反應(yīng)40 min隨后測(cè)定標(biāo)記為A0，對(duì)照組替換紅枸杞葉樣液、黑枸杞葉樣液為去離子水測(cè)定得A2。以K1（%）表示其DPPH清除率。

1.2.6.2 黑枸杞葉提取液對(duì)羥自由基的清除能力 參考劉皓涵等[18]的方案略作修改，精準(zhǔn)移取新鮮配制的一系列濃度黑枸杞葉和紅枸杞葉提取樣液分別與等體積1.76 mM的FeSO4（當(dāng)日新鮮配置）、等體積1.76 mM的水楊酸-乙醇（其以50%乙醇為溶劑）均勻混合，隨后加入等體積1.76 mM的H2O2（加入即刻啟動(dòng)反應(yīng)），37℃避光恒溫反應(yīng)至30 min后，即刻測(cè)定其于510 nm波長(zhǎng)處的吸光值并標(biāo)記為A'1。以紅枸杞葉/黑枸杞葉樣液與3倍體積無(wú)水乙醇均勻混合測(cè)定吸光值標(biāo)記為A'0，以蒸餾水替代紅枸杞葉/黑枸杞葉樣液為空白對(duì)照標(biāo)記為A'2。以K2（%）表示其羥自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞葉總多酚提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖1可知，隨著微波功率逐步增加，黑枸杞葉總多酚的萃得率顯示出早期增加后期降低的態(tài)勢(shì)，此因微波作用影響破壞了一部分氫鍵以及分子間作用力，破壞了黑枸杞葉細(xì)胞，而隨著該作用力進(jìn)一步增強(qiáng)，會(huì)促使部分植物多酚物質(zhì)被同步損壞[21]、提取溶劑進(jìn)一步揮發(fā)，且提取溫度變得更難以控制，需要更多的間歇時(shí)長(zhǎng)以保持溫度恒定，進(jìn)而致使萃得量下降。微波功率達(dá)到200 W時(shí)，提得量最高達(dá)4.39 mg/g，因故，最適微波功率選取200 W為宜。

圖1 微波功率對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.1 Effects of microwave power on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.2 液料比對(duì)黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖2可得知，隨著液料比的增加，黑枸杞葉總多酚得率先增加后降低，這是由于初期黑枸杞葉細(xì)胞中多酚物質(zhì)與提取溶劑乙醇的濃度差與接觸面積逐步增大，且溶劑分子愈多，則超聲波作用下的傳質(zhì)動(dòng)力也愈大，進(jìn)而助力多酚類(lèi)物質(zhì)的溶解及浸出[22]，后期則有更多的雜質(zhì)被溶出影響了目標(biāo)物的提取，且過(guò)分劇烈的空化效應(yīng)及超聲作用力也將黑枸杞葉胞內(nèi)多酚物質(zhì)破壞。當(dāng)液料比為20:1（mL/g）時(shí)，其萃得量最高可達(dá)4.72 mg/g。當(dāng)液料比超出20:1（mL/g）時(shí)，或因其余溶解物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制致使萃得率減少。故而，黑枸杞葉多酚萃取的最適液料比選取20:1（mL/g）為宜。

圖2 液料比對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratio on the extraction amount of black wolfberry leaf

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖3可看出，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，黑枸杞葉總多酚的得率呈現(xiàn)6～12 min增加，隨后再降低的態(tài)勢(shì)。初期隨著協(xié)同萃取時(shí)長(zhǎng)的增加，更多的細(xì)胞被破壞使得目標(biāo)黑枸杞葉多酚物質(zhì)溶出，而隨著時(shí)間的進(jìn)一步增加，目的萃取物也被破壞。協(xié)同萃取時(shí)間達(dá)到12 min時(shí)，萃得量最高達(dá)4.16 mg/g。

圖3 時(shí)間對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖4可看出隨著提取溶劑乙醇所占體積分?jǐn)?shù)的增加，黑枸杞葉總多酚得率先增加后降低，前期的增加是由于溶質(zhì)分子的存在有助于其余溶質(zhì)分子的溶出，進(jìn)而助力于黑枸杞葉多酚類(lèi)物質(zhì)的浸出[23]，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，其提取量最高達(dá)4.34 mg/g。

圖4乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.5 超聲功率對(duì)黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖5可看出，隨著超聲功率的提高，黑枸杞葉總多酚的萃得率在100～400 W持續(xù)增加，或因超聲波的強(qiáng)大機(jī)械與空化作用力破壞了黑枸杞葉的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜、細(xì)胞間質(zhì)，促使其胞內(nèi)物質(zhì)迅速溶解釋放。當(dāng)功率超出400 W后，過(guò)分大的作用力又促使著其酚類(lèi)物質(zhì)更多地發(fā)生了包括聚合、氧化在內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)[24]，與此同時(shí)對(duì)黑枸杞葉中諸如鄰二酚羥基等[25]多酚類(lèi)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)造成損壞，降低了萃取率。因而，選取超聲功率400 W為該提取液的最宜條件，試驗(yàn)表明其最高提取量達(dá)5.622 mg/g。

圖5 超聲波功率對(duì)黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化黑枸杞葉多酚提取試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)際結(jié)果，將影響較小的乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為50%不變，液料比設(shè)置為20:1（mL/g）不變，同時(shí)固定萃取溫度為70℃，選用超聲功率、微波功率、時(shí)間為自變量，以黑枸杞葉總多酚萃得量（率）為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。具體試驗(yàn)方案及結(jié)果分析見(jiàn)表2。本試驗(yàn)采用Design-Expert 12.0軟件對(duì)表2所示結(jié)果值進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，獲得黑枸杞葉總多酚萃得率為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=5.83 0.067 4A 0.199 4B 0.311 0C+0.204 6AB+0.209 3AC 0.282 4BC 0.611 3A20.396 2B20.684 5C2，由二次項(xiàng)系數(shù)皆為負(fù)數(shù)可知，拋物線開(kāi)口朝下，擁有極大值點(diǎn)。表3所示的方差分析結(jié)果表明：模型回歸為極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)為不顯著（P＞0.05），預(yù)示外界其余因素對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果干擾并不顯著。模型的決定系數(shù)為R2=0.983 4，表明實(shí)際測(cè)試所得數(shù)據(jù)與回歸方程之間展現(xiàn)良好吻合關(guān)系，能夠較好反映出黑枸杞葉多酚萃得量與超聲功率、微波功率與萃取時(shí)間的關(guān)系。同時(shí)可知，各因素對(duì)萃得率的影響大小為：C＞B＞A，且一次項(xiàng)B和C、交互項(xiàng)BC、二次項(xiàng)A2、B2及C2對(duì)萃得率有極顯著影響（即P＜0.01）；交互項(xiàng)AB、AC對(duì)萃得率有顯著影響（即P＜0.05）。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 experimental design and results of Box-Behnken

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.2.2 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)2.2.1中回歸方程二次模型所制作的黑枸杞葉總酚提取模型響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖見(jiàn)圖6和圖7。圖6和圖7分別反映了3個(gè)因素（超聲功率、微波功率和萃取時(shí)間）兩兩交互作用情況下對(duì)響應(yīng)值的影響，若等高線坡度較為平緩、狀似圓形表明該兩種因素之間交互作用較不顯著[21,24,25]，若坡度陡峭、排列緊密且狀似橢圓形則表示二因素之間的交互作用相對(duì)明顯[19,22]。由圖6、圖7可得，時(shí)間和萃取微波功率、超聲功率為0水平時(shí)，隨著各水平因素的變化黑枸杞葉多酚提取量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。由等高線圖可知，超聲功率與萃取時(shí)間的響應(yīng)面相對(duì)更為陡峭，同時(shí)等高線狀似橢圓，說(shuō)明二者間的交互作用強(qiáng)烈[20]，于黑枸杞葉總萃得率的影響極顯著；微波功率與萃取時(shí)間、微波功率與超聲功率的響應(yīng)面相對(duì)平緩，等高線形狀更近圓形，說(shuō)明交互作用相對(duì)較小，但仍交互作用顯著。此結(jié)論與表3所示方差分析P值等結(jié)果一致。

圖6 時(shí)間與微波功率對(duì)黑枸杞葉多酚提得量的交互影響Fig.6 Interaction effects of time and microwave power on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

圖7 時(shí)間與超聲功率對(duì)黑枸杞葉多酚提得量的交互影響Fig.7 Interaction effects of ultrasonic power and extraction time on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

圖8 微波功率與超聲功率對(duì)黑枸杞葉多酚提得量的交互影響Fig.8 Interaction effects of microwave power and ultrasonic power on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)優(yōu)化后的黑枸杞葉多酚提取方程求解，得出試驗(yàn)分為內(nèi)最佳條件：微波功率187.498 W、萃取時(shí)間為11.596 min、超聲功率378.76 W；實(shí)際試驗(yàn)條件下最佳提取工藝為：微波功率190 W、萃取時(shí)間為11.6 min、超聲功率380 W。重復(fù)3次試驗(yàn)，黑枸杞葉多酚平均提取量為6.02 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本擬合，表明該優(yōu)化模型可靠。

2.3 黑枸杞葉/紅枸杞葉提取物體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 如圖9所示，黑枸杞葉和紅枸杞葉兩種枸杞樣品葉均具備DPPH自由基清除能力，且該清除力的強(qiáng)弱與兩樣品提取液濃度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，表明二者均具有抗氧化活性。其中黑枸杞葉樣品的上升幅度更為明顯，在同樣濃度時(shí)，黑枸杞葉提取液的體外DPPH自由基清除能力均高于紅枸杞葉。

圖9 紅枸杞葉與黑枸杞葉總多酚提取物對(duì)DPPH自由基清除能力對(duì)比Fig.9 The scavenging ability of red wolfberry leaf extract and black wolfberry leaf extract on DPPH free radical

2.3.2 羥基自由基清除能力 如圖10，羥自由基清除能力也隨著黑枸杞葉和紅枸杞葉樣品濃度的增加而明顯提升。在總酚質(zhì)量濃度均為80ug/mL附近時(shí)，紅枸杞葉、黑枸杞葉的總酚提取物體外對(duì)OH的清除能力分別為70%和78%，清除力百分比增長(zhǎng)明顯放緩，這或許與硒元素的量增加放緩有關(guān)[24-26]。

圖10 紅枸杞葉與黑枸杞葉總酚提取物對(duì)羥自由基的清除能力比較Fig.10 The scavenging ability of red wolfberry leaf extract and black wolfberry leaf extract on hydroxy free radical

3 結(jié)論

3.1 本研究采取微波 超聲波協(xié)同萃取法，以乙醇為提取溶劑探索超聲功率、微波功率、時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比5個(gè)因素作為自變量時(shí)對(duì)黑枸杞葉多酚提取率的影響，隨后采取響應(yīng)面法優(yōu)化黑枸杞葉中多酚提取率，獲知最佳工藝參數(shù)為：在溫度為70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比20:1（mL/g）時(shí)，微波功率190 W、萃取時(shí)間為11.6 min、超聲功率380 W條件下多酚提取率為6.02 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，表明該模型能夠用于黑枸杞葉多酚提取工藝優(yōu)化。

3.2 通過(guò)對(duì)黑枸杞葉和紅枸杞葉中總酚提取物的體外抗氧化能力測(cè)定表明，黑枸杞葉的羥自由基清除率及DPPH自由基清除率均全面優(yōu)于紅枸杞葉，可為黑枸杞葉的開(kāi)發(fā)再利用提供理論支持。