山羊DNMT3B和KHDRBS2多態(tài)性及其與繁殖性能關(guān)聯(lián)分析

李昆諭，劉玉芳，陶林，江炎庭，歐陽依娜，儲明星※，洪瓊花※

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056001；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193）

山羊（Capra hircus）作為人類最早馴養(yǎng)的動物之一，有著10 000多年的馴養(yǎng)歷史，在人類農(nóng)業(yè)文明和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要的作用，為人類提供肉、奶、皮和毛等生活資料[1]。山羊繁殖性狀是一個復(fù)雜的性狀，受到多種因素的影響，且繁殖性狀遺傳力較低（0.1左右），是一種微效多基因控制的閾性狀[2]。由于山羊世代間隔較長，運用傳統(tǒng)育種手段很難達(dá)到快速提高產(chǎn)羔數(shù)的目的[3]。目前影響山羊多羔的主效基因尚未被發(fā)現(xiàn)，為了加快山羊育種工作的進(jìn)程，尋找影響山羊產(chǎn)羔性狀的主效基因勢在必行?；?qū)ι窖虍a(chǎn)羔性狀的影響很大，主要表現(xiàn)在對母羊排卵數(shù)的影響上，而影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的主要因素之一就是母羊的排卵數(shù)。不同基因?qū)π玛惔x、生理途徑和表型表達(dá)的影響是不同的，具有不同的協(xié)同或拮抗作用。因此，研究影響山羊產(chǎn)羔性狀的候選基因并確定引起性狀變異的原因是至關(guān)重要的。山羊育種改良的研究主要集中于繁殖性狀的重要候選基因上，選擇這些基因的有利等位基因可能有助于高產(chǎn)育種群體的建立，對山羊的選育工作有持續(xù)深遠(yuǎn)的影響。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNA methyltransferase 3 beta,DNMT3B）是一種編碼哺乳動物胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化所必需的從頭甲基化酶，DNMT3B定位于山羊第13號染色體，CDS區(qū)由22個外顯子組成，是DNMT家族中的一個重要成員[4]。有文獻(xiàn)報道DNMT3B功能是特異性地參與重復(fù)DNA序列中CpG二核苷酸的甲基化[5]。DNMT3B存在于真核細(xì)胞染色體的中心衛(wèi)星部分，雖然DNMT3B的主要功能是從頭甲基化，但它也有維持甲基化的作用，DNMT3B也參與了卵母細(xì)胞的發(fā)育和卵子的排出等過程[5]。DNMT3B參與了動物生殖細(xì)胞的發(fā)育，在動物早期胚胎發(fā)育中也發(fā)揮著一定的作用[4,6,7]。

KHDRBS2定位于山羊第23號染色體上，擁有9個外顯子。KHDRBS2屬于KHDRBS家族中的一員，是一種RNA結(jié)合蛋白，KHDRBS家族屬于一類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及RNA激活超家族，此超家族成員與hnRNP K有同源結(jié)構(gòu)域即KH結(jié)構(gòu)域，均屬于核糖蛋白并在進(jìn)化上高度保守[8]。Salehian-Dehkordi H等[9]研究表明，KHDRBS2的拷貝數(shù)變異（CNV）與綿羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。本研究的候選基因來自實驗室前期基于重測序數(shù)據(jù)，通過GWAS分析（顯著性閾值為0.05）所得在云上黑山羊（云上黑山羊是以云嶺山羊為母本、努比山羊為父本培育而成的我國第一個肉用黑山羊品種[10,11]）全基因組中的正選擇基因（positively selected genes,PSG）發(fā)現(xiàn)，DNMT3B和KHDRBS2共有6個SNPs位點，其中DNMT3B為g.61480806G＞A、g.61491787C＞T，KHDRBS2為g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C。我們采用了MassARRAY SNP分型技術(shù)，在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊3個山羊群體中對候選基因的基因型進(jìn)行檢測，分析其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)性狀之間的關(guān)聯(lián)性，以期能夠為山羊的高繁殖力性狀選育工作提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

實驗共采集768只山羊（2～5歲）的血液，其中云上黑山羊544只、濟(jì)寧青山羊133只、遼寧絨山羊91只。本實驗將濟(jì)寧青山羊視為高繁殖力群體（平均產(chǎn)羔率283%），遼寧絨山羊視為低繁殖力群體（平均產(chǎn)羔率115%）[10,11]。所有試驗用山羊飼養(yǎng)條件環(huán)境一致，云上黑山羊擁有至少1胎產(chǎn)羔數(shù)記錄，部分擁有初生窩重和斷奶窩重（3月齡）記錄，所有羊均采用頸靜脈采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，-20℃保存。

1.2 血液DNA的提取

試驗樣本使用酚氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop2000檢測DNA樣本濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

表1 被測山羊品種及個體數(shù)量信息Table 1 Information on the breeds of goats tested and the number of individuals

1.3 基因分型

采用Sequenom MassARRAY SNP分型技術(shù)對DNMT3B和KHDRBS2基因SNPs位點進(jìn)行檢測，相關(guān)引物信息見表2，分型所用樣品為先前提取的基因組DNA，每個樣品需要量為20uL，DNA濃度為40～80 ng/uL。

表2 引物序列Table 2 Sequence of primer

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Excel軟件統(tǒng)計山羊DNMT3B和KHDRBS2基因SNPs位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用IBMSPSS Statistics 25軟件中的一般線性模型，多重比較采用LSD法，對云上黑山羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNMT3B多態(tài)性分析

利用Sequenom MassARRAY SNP對768只山羊血液DNA進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示，DNMT3B g.61480806G＞A和g.61491787C＞T位點在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊3個山羊群體中均存在多態(tài)性，其中g(shù).61480806G＞A位點基因型為GG、GA、AA，g.61491787C＞T位點基因型為CT、TT（圖1）。

圖1 DNMT3B基因位點分型結(jié)果Fig.1 Results of DNMT3B gene locus typing

對濟(jì)寧青山羊（高繁）和遼寧絨山羊（低繁）山羊品種中DNMT3B 2個SNPs位點的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計（見表3），其中，DNMT3B g.61491787C＞T位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；g.61491787C＞T位點在高繁群體和低繁群體的優(yōu)勢基因型為TT，優(yōu)勢等位基因為T。

表3 DNMT3B和KHDRBS2 6個多態(tài)位點在高繁、低繁山羊品種中的基因型和等位基因頻率Table 3 Genotypes and allele frequencies of 6 polymorphic loci of DNMT3B and KHDRBS2 in high-and low-reproduction goats breeds

群體遺傳學(xué)統(tǒng)計表明，DNMT3Bg.61480806G＞A位點在云上黑山羊中為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），在濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）；DNMT3B g.61491787C＞T在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊3個山羊群體中均為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ竭m合性檢驗結(jié)果表明，DNMT3B兩個SNPs位點在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊3個山羊群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）（表4）。

2.2 KHDRBS2多態(tài)性分析

對KHDRBS2進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示KHDRBS2 4個候選位點（g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C）在3個山羊群體中均存在多態(tài)性（圖2）。其中，KHDRBS2 g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C 3個位點在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊3個山羊群體中存在3種基因型，g.47872502C＞T位點只在云上黑山羊中存在多態(tài)性（見表4）。

圖2 KHDRBS2位點分型結(jié)果Fig.2 The results of KHDRBS2 locus typing

如表3所示，KHDRBS2 g.48441325T＞C和g.48441364C＞T位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但g.48610246G＞C位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異不顯著（P＞0.05）。其中，g.48441325T＞C和g.48441364C＞T位點在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢基因型為CC，優(yōu)勢等位基因均為C；g.48610246G＞C位點在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢基因型為GG，優(yōu)勢等位基因均為G。

由表4可知，KHDRBS2 g.48441364C＞T位點在3個山羊群體中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），KHDRBS2 g.47872502C＞T、g.48441325T＞C和g.48610246G＞C位點在3個山羊群體中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ綑z驗表明，KHDRBS2g.48610246G＞C位點在3個山羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T 3個位點在云上黑山羊中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表4 DNMT3B和KHDRBS2 6個多態(tài)位點在不同山羊品種中的群體遺傳學(xué)分析Table 4 Population genetic analysis for 6 polymorphic loci of DNMT3B and KHDRBS2 in different goat breeds

2.3 候選SNPs位點與云上黑山羊繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

DNMT3B g.61491787C＞T位點TC型個體的初生窩重和斷奶窩重顯著高于TT型個體（P＜0.05）；KHDRBS2 g.47872502C＞T位點CC型個體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT型個體（P＜0.05），g.48441364C＞T位點CC型個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT型和TT型個體（P＜0.05）。其余位點多態(tài)性與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重?zé)o顯著相關(guān)（P＞0.05）（表5）。

表5 DNMT3B和KHDRBS2對云上黑山羊繁殖性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）Table 5 The influence of DNMT3B and KHDRBS2 on the reproduction performance of Yun shang black goats(mean±standard error)

3 討論

3.1 DNMT3B與生殖性狀的關(guān)系

DNMT3B是哺乳動物發(fā)育所必需的一種甲基化酶，參與動物生理活動的多個方面，有研究表明DNMT3B的缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎的死亡[12-14]。DNMT3B在哺乳動物的繁殖發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，卵母細(xì)胞的發(fā)育過程中需要DNMT3B進(jìn)行甲基化調(diào)控，以保證卵子正常排出[15,16]?，F(xiàn)階段關(guān)于DNMT3B基因多態(tài)性與山羊繁殖關(guān)系的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3B g.61480806G＞A位點在云上黑山羊中為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），說明這個群體有較大的遺傳變異程度和較豐富的遺傳多樣性，該位點依然具有可觀的選擇潛能。DNMT3B g.61491787C＞T位點TC型初生窩重和斷奶窩重顯著高于TT型。DNMT3Bg.61491787C＞T位點或可作為云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重選擇的一個潛在分子標(biāo)記。

3.2 KHDRBS2基因與生殖性狀的關(guān)系

KHDRBS2作為KHDRBS家族蛋白的一員，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA選擇性剪接等多種生物學(xué)進(jìn)程，不僅如此，KHDRBS家族蛋白作為RBP在神經(jīng)突觸功能聯(lián)系、精子發(fā)生、脂肪細(xì)胞分化調(diào)控等一些重要的過程中發(fā)揮一定的作用[17,18]。與其他RNA結(jié)合蛋白類似，KHDRBS家族蛋白在細(xì)胞信號通路中扮演著調(diào)節(jié)點的作用，細(xì)胞內(nèi)外的信號調(diào)控各種激酶對KHDRBS家族蛋白的翻譯后修飾以及KHDRBS家族蛋白與靶標(biāo)RNA的結(jié)合，三者間的動態(tài)平衡對下游基因的表達(dá)有重要影響[19,20]。目前，關(guān)于KHDRBS2與山羊繁殖性狀之間關(guān)系的研究報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，KHDRBS2 g.48441364C＞T位點在3個山羊群體中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），說明該基因在多個群體中有較大的遺傳變異程度和較豐富的遺傳多樣性。KHDRBS2 g.47872502C＞T位點CC型個體產(chǎn)羔數(shù)高于CT型個體0.278只，g.48441364 C＞T位點CC型個體產(chǎn)羔數(shù)分別高于CT型和TT型個體0.114只和0.12只。KHDRBS2 g.47872502 C＞T和g.48441364C＞T這兩個突變導(dǎo)致了云上黑山羊產(chǎn)羔性狀表型的變化，可見其對于云上黑山羊母羊的繁殖力是有一定的影響的。因此，KHDRBS2g.47872502C＞T和g.48441364C＞T兩個位點或可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

綜上所述，DNMT3Bg.61491787C＞T位點與云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊窩重的選擇。KHDRBS2 g.47872502C＞T和g.48441364C＞T位點與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。