二甲雙胍對高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟維生素B12的影響及維生素B12與糖脂代謝的關系*

簡 穎， 郭婉蓉， 劉子瑜， 梁 華， 蔡夢茵， 許 雯， 徐 芬

（中山大學附屬第三醫(yī)院，廣東省糖尿病防治重點實驗室，廣東 廣州 510630）

隨著人口老齡化與生活方式的變化，我國2 型糖尿病的患病率從1980年的0.67%［1］飆升至2017年的11.2%［2］。2 型糖尿病已成為我國主要的慢性病及老年病之一。二甲雙胍（metformin，Met）因具有降糖效果明確、減輕體重、致低血糖風險小和降低心血管事件及死亡率等優(yōu)點而被眾多糖尿病診治指南推薦為2 型糖尿病患者降糖治療的一線用藥和藥物聯(lián)合治療中的基本用藥［3］。然而，既往有臨床研究提示Met可導致血清維生素B12水平下降甚至缺乏，從而引起巨幼細胞貧血和周圍神經(jīng)病變的可能［4-7］。

天然的維生素B12 由自然界微生物合成，高等動植物均不能靠自身合成［8］。人體獲取它的主要方式是動物來源的食物，長期素食可導致維生素B12的缺乏，且它的吸收與胃腸道功能和狀態(tài)密切相關［8］。食物中的維生素B12 與胃壁細胞分泌的內因子結合后，在回腸被機體吸收［9］。由于腸道菌群參與了Met 抑制機體吸收內因子-維生素B12 復合體的過程［10］，而飲食作為對腸道菌群有重要影響的因素，可能在Met 抑制腸道維生素B12 吸收中起重要的作用。因此，本項工作擬在動物模型中探討高脂飲食（high-fat diet，HFD）喂養(yǎng)下，Met 的干預是否影響C57BL/6J小鼠血清和肝臟中的維生素B12水平。

此外，臨床研究提示血清維生素B12 缺乏與肥胖、脂代謝紊亂以及胰島素抵抗等異常狀態(tài)亦有關聯(lián)［11-16］，而肝臟維生素B12 與它們之間的研究較少，本項工作將探討HFD誘導的肥胖小鼠模型中血清和肝臟維生素B12 水平與糖脂代謝表型之間的相關性。

材料和方法

1 實驗動物模型的建立和干預方法

SPF 級 C57BL/6J 雄性小鼠 20 只，7～8 周齡，21～25 g，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號為SCXK（蘇）2018-0008。動物飼養(yǎng)于中山大學SPF 級實驗動物中心，飼養(yǎng)室溫度（22±2）℃，光照周期為明暗交替12 h，可自由獲取飼料和水。適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機將小鼠分為普通飲食（chow diet，CD）組和HFD 組，分別給予普通飼料（熱卡百分比碳水化合物占68%，脂肪占11%，蛋白質占21%）和高脂飼料（Research Diets，貨號D12331；熱卡百分比碳水化合物占25.5%，脂肪占58%，蛋白質占16.4%）喂養(yǎng)。HFD 喂養(yǎng)12 周誘導肥胖2 型糖尿病小鼠模型［17］，造模成功后，將不同飲食的小鼠再各自隨機地分為兩組，小鼠分別可自由獲取含或不含Met 的飲用水，干預為期 4 周，Met（Selleck，貨號 S1950）的攝入劑量為250 mg·kg-1·d-1［18］。即分為 4組，分別為CD組、CD Met 組、HFD 組和 HFD Met 組，每組 5 只小鼠。每2 周收集小鼠體重和空腹血糖的數(shù)據(jù)。干預結束后，異氟烷吸入麻醉并使用頸椎脫臼法處死小鼠，采集血樣和肝臟組織標本。新鮮全血靜置半小時后進行離心，離心條件為1 700×g、4 ℃、20 min，收集血清放入-80 ℃冰箱保存。取適量肝臟組織標本置于4%多聚甲醛中固定后做組織學染色實驗，其余組織放于-80 ℃冰箱保存。以上實驗獲中山大學動物實驗倫理委員會批準。

2 實驗試劑和方法

2.1 肝臟甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）的測定 分別采用TG 定量比色試劑盒（BioVision，貨號K622-100）和TC 定量比色試劑盒（BioVision，貨號 K603-100）測定肝臟 TG 和TC 水平：（1）TG：取 20 mg 肝臟組織，加入200 μL 5%NP-40 溶液勻漿，勻漿完全后90 ℃金屬浴加熱5 min，冷卻至室溫后重復加熱1 次，20 000×g、25 ℃離心2 min 后吸取上層清液，即獲取肝臟甘油三酯測定的原液；（2）TC：以7∶11∶0.1 的比例配制氯仿、異丙醇和NP-40 的混合液，稱取20 mg 肝臟組織，加入400 μL 的混合液進行勻漿，15 000×g、25 ℃離心 10 min 后小心吸取上層液體至新的EP 管，并于50 ℃中干燥，完成干燥后再放入真空環(huán)境下30 min，最后，用400 μL 膽固醇測定緩沖液溶解干燥的脂質，渦旋均勻，即獲取肝臟膽固醇測定的原液。后續(xù)操作嚴格按照BioVision試劑盒說明書進行實驗。

2.2 血清和肝臟維生素B12 的測定 采用維生素B12 ELISA 試劑盒（BioVision，貨號 E4638-100）。（1）血清維生素B12 的測定：血清稀釋5 倍后，嚴格按照該ELISA 試劑盒說明書進行操作，依次進行加樣、孵育、洗滌、加酶、顯色、測定吸光度（A）。通過標準品繪制標準曲線，根據(jù)各樣品的A值算出對應的濃度（μg/L），再乘以稀釋倍數(shù)得到血清實際的維生素B12濃度。（2）肝臟維生素 B12 的測定：取 10 mg 肝臟組織，用冷凍的 1×PBS 溶液（GBCBIO Technologies，貨號G3524-2L）徹底清洗肝臟多余的溶血，加入90 μL的1×PBS 溶液以及1%蛋白酶抑制劑（Thermo Scientific，貨號 78440）后充分勻漿，5 000×g、4 ℃離心 5 min后收集上清，再依次進行加樣、孵育、洗滌、加酶、顯色、測定吸光度（A）值和繪制標準曲線，最后計算出的肝臟維生素B12 濃度（μg/L），并用肝蛋白濃度（g/L）進行校正。

2.3 肝臟H&E 染色 將肝臟組織置于4%多聚甲醛溶液（GBCBIO Technologies，貨號G0528）中固定過夜。石蠟包埋后，在室溫下切片，厚度為3～5 μm。按照H&E 染色步驟依次對切片進行脫蠟、染色、脫水、透明和封片。使用DMi8倒置顯微鏡（Leica）拍照采集肝臟形態(tài)學圖片。

2.4 肝臟油紅O 染色 將肝臟組織置于4%多聚甲醛溶液（GBCBIO Technologies，貨號G0528）中固定過夜，依次用20%及30%蔗糖溶液脫水24 h，脫水后經(jīng)OCT（SAKURA，貨號4583）包埋進行切片，切片時溫度在-18 ℃，厚度為6～8 μm。按照每0.15 g 油紅O粉末溶于30 mL異丙醇的比例配制油紅O儲存液，再以油紅儲存液∶雙蒸水=3∶2配制油紅工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。肝臟冰凍切片于油紅工作液中染色1h，并在雙蒸水下輕柔沖洗20 min；然后用蘇木精染核及鹽酸乙醇分色；最后用10%甘油封片；封片后用DMi8 倒置顯微鏡（Leica）進行拍照。染色全程以及拍片時均在避光條件下進行，整個過程在2 h內完成。

3 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）的形式表示。多組計量資料比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。雙變量符合正態(tài)分布的相關性分析采用Pearson 相關檢驗，若不符合正態(tài)分布則采用Spearman 相關檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HFD 喂養(yǎng)小鼠的體重、血糖、血脂以及肝臟脂質顯著增加

與CD 組相比，HFD 組小鼠體重和肝重顯著增加（P＜0.05）；空腹血糖、血TG 水平及血TC 水平顯著上升（P＜0.05）；肝臟TG和TC均顯著增加（P＜0.05），見圖1。肝臟組織的HE染色顯示高脂組的肝細胞空泡增多，油紅O 染色顯示高脂組的肝細胞脂滴染色更紅，見圖2。

2 Met干預對HFD喂養(yǎng)小鼠糖脂代謝的改善作用

與HFD 組對比，HFD Met 組小鼠體重和肝重顯著減輕（P＜0.05）；空腹血糖、肝臟TG 和肝臟TC 均顯著下降（P＜0.05），見圖1。肝臟組織的HE 染色顯示Met干預的HFD組肝細胞空泡數(shù)量減少，油紅O染色顯示Met 干預的HFD 組肝細胞脂滴紅染程度減輕，見圖2。

3 Met 干預對HFD 喂養(yǎng)的小鼠血清和肝臟維生素B12的影響

4 組小鼠的血清維生素B12 水平兩兩比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3A；但小鼠肝臟維生素B12的水平，HFD Met 組與 CD Met 組對比顯著下降（P＜0.01），HFD Met 組與 HFD 組對比也顯著下降（P＜0.05），見圖3B。

4 Met 干預HFD 喂養(yǎng)的肥胖2 型糖尿病小鼠后肝臟維生素B12 水平與糖脂代謝各指標間的相關性分析

CD Met組和HFD Met組這兩個藥物干預組小鼠的肝臟維生素B12 與各糖脂代謝表型做相關性分析：肝臟維生素B12 水平與體重（r=-0.660，P＜0.05）、肝重（r=-0.881，P＜0.01）、空腹血糖（r=-0.801，P＜0.01）、血清TG水平（r=-0.917，P＜0.01）、血清TC 水平（r=-0.873，P＜0.01）、內臟脂肪組織重量（r=-0.753，P＜0.05）和皮下脂肪組織重量（r=-0.759，P＜0.05）呈顯著負相關；肝臟維生素B12 水平與肝臟TG含量（r=-0.126，P=0.728）和肝臟TC含量（r=0.045，P=0.933）未觀察到相關性，見圖4。

5 Met 干預HFD 喂養(yǎng)的肥胖2 型糖尿病小鼠后血清維生素B12 水平與糖脂代謝各指標間的相關性分析

Figure 1. Comparison of glucose and lipid metabolism phenotypes in different groups. Mean±SEM. n=5.*P＜0.05 vs CD group；#P＜0.05 vs HFD group.圖1 四個組間的糖脂代謝指標對比

Figure 2. Liver histological staining. A：HE staining；B：oil red O staining. The images indicated that liver lipid deposition was aggravated in the mice fed with high-fat diet（HFD），and metformin（Met）could alleviate hepatic steatosis.圖2 小鼠肝臟組織學染色

CD Met組和HFD Met組這兩個藥物干預組小鼠的血清維生素B12 與各糖脂代謝表型做相關性分析：血清維生素B12 水平與體重（r=0.221，P=0.539）、肝重（r=-0.327，P=0.357）、空腹血糖（r=0.107，P=0.769）、血清 TG 水平（r=-0.282，P=0.431）、血清TC 水平（r=-0.008，P=0.983）、內臟脂肪組織重量（r=0.181，P=0.617）、皮下脂肪組織重量（r=0.164，P=0.651）、肝臟TG 含量（r=0.513，P=0.129）和肝臟TC 含量（r=-0.707，P=0.116）均未觀察到相關性，見圖5。

討 論

口服Met 治療2 型糖尿病導致血清維生素B12的缺乏在臨床報道中較為常見［4-7］，可引起或加重神經(jīng)病變和血液系統(tǒng)疾病［19］。然而亦有研究指出Met的使用與血清維生素B12缺乏無顯著相關性［20-21］；有薈萃分析提示雖然Met 使血清維生素B12 水平下降并增加維生素B12 缺乏的發(fā)生風險，但與貧血和神經(jīng)病變無顯著關聯(lián)［22］。新版的Met 臨床應用專家共識中提到其禁忌癥時，把維生素B12 缺乏未糾正者囊括進來［23］；而在闡述Met對維生素B12的吸收是否產(chǎn)生影響時，表明仍未有定論；但共識建議長期使用Met者可每年測定一次維生素B12 的水平，如缺乏應適當補充維生素 B12［23］。

Figure 3. Serum and liver vitamin B12 levels in the 4 groups. A：there was no statistical difference in serum vitamin B12 level among all groups；B：liver vitamin B12 level decreased in HFD Met group compared with CD Met group. Mean±SEM. n=5. ??P＜0.01 vs CD Met group；#P＜0.05 vs HFD group.圖3 四個組血清和肝臟維生素B12的含量

Figure 4. Correlation analysis between liver vitamin B12 level and glucose and lipid metabolic phenotypes in CD Met group and HFD Met group. VAT：visceral adipose tissue；SAT：subcutaneous adipose tissue. r was Pearson correlation coefficient；P＜0.05 was considered statistically significant.圖4 肝臟維生素B12與糖脂代謝各指標間的相關性分析

Figure 5. Correlation analysis between serum vitamin B12 level and glucose and lipid metabolic phenotypes in CD Met group and HFD Met group. No correlation was showed between serum vitamin B12 level and the glucolipid metabolic phenotypes.VAT：visceral adipose tissue；SAT：subcutaneous adipose tissue. r was Pearson correlation coefficient；P＜0.05 was considered statistically significant.圖5 血清維生素B12與糖脂代謝各指標間的相關性分析

本研究旨在探討HFD 喂養(yǎng)的肥胖2 型糖尿病小鼠模型中，Met的干預是否影響維生素B12 在血清和肝臟中的水平。我們觀察到C57BL/6J肥胖小鼠的禁食血糖出現(xiàn)升高［（11.58±0.55）mmol/L］，因此我們把C57BL/6J 肥胖小鼠模型歸為2 型糖尿病模型。從糖脂代謝表型及肝臟病理學結果方面分析，HFD 喂養(yǎng)的小鼠發(fā)生了糖脂代謝紊亂和肝臟脂肪變性，且Met能緩解上述病變，這提示我們的造模是成功的。

與既往研究相比，我們觀察到在食物中維生素B12 供應正常的情況下，單用Met 對不同飲食（HFD和CD）的小鼠血清總維生素B12 影響較??；并且我們率先觀察到Met 可導致HFD 喂養(yǎng)小鼠的肝臟維生素B12 水平的下降。肝臟作為維生素B12 主要的儲存器官，其維生素B12含量下降應是機體維生素B12缺乏最初的表現(xiàn)，這與我們最初假設Met 能導致肝臟維生素B12的缺乏相一致。目前，關于2型糖尿病患者在服用Met 后是否引起肝臟維生素B12 變化的研究較少，需在臨床Met 治療前后的肝臟穿刺標本中行進一步的驗證，在實際操作中存在較大的困難。而Met 所致維生素B12 降低的病理生理機制目前仍未完全闡明，較為一致的觀點是與Met 干擾維生素B12 的吸收［24-33］以及 Met 使維生素 B12 的組織重分布［34］有關。其中，有研究［24-25］認為Met 可導致腸道菌群過度增生，使內因子-維生素B12 復合體更多與細菌結合，同時腸道菌群改變也可導致胃腸道蠕動及回腸形態(tài)的改變，進一步減少機體對它的吸收。但遺憾的是本研究未進行小鼠腸道菌群的檢測以及腸道標本的收集，后續(xù)研究可對此進行完善。此外，文獻提示肝組織中維生素B12 水平受到肝細胞膜上CD320受體和TCN-II的調節(jié)［35］，Met是否通過影響肝臟CD320受體和TCN-II的表達從而導致肝內維生素B12 的缺乏還需更深入地研究；另一方面，本研究觀察到小鼠肝臟維生素B12 水平與體重、肝重、血脂水平、空腹血糖呈中-高度負相關，這提示在Met干預下HFD 喂養(yǎng)的肥胖合并2 型糖尿病小鼠肝臟維生素B12 的降低與惡化的糖脂代謝表型相關。這與既往采用血清維生素B12 作為評價機體維生素B12 狀態(tài)的臨床研究相比［11-16］，其一致性為機體維生素B12水平越低糖脂代謝相關的指標越差；但差異在于肝臟中而非血清中的維生素B12 水平可能才是反應Met所致維生素B12 缺乏的主要指標。鑒于本研究只在C57BL/6J 小鼠模型中進行，該結論還需在更多糖脂代謝紊亂的模型小鼠甚至人群中進行驗證。

本研究具有一定的局限性和片面性，在評價血清維生素B12狀態(tài)時只測定了總的維生素B12水平，未測定能夠反應維生素B12 功能和活性的其他指標，如血清全反鈷胺素（holotranscobalamin，HoloTC）、甲基丙二酸（methylmalonic acid，MMA）和同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）。維生素B12 作為甲基丙二酰輔酶A 轉變?yōu)殓牾］o酶A 以及同型半胱氨酸轉化為甲硫氨酸所必需的輔酶，若出現(xiàn)缺乏或功能障礙，血清 MMA 和 Hcy 水平會升高［36］。此外，本研究雖保證了不同飲食中維生素B12 的補充量可以滿足小鼠正常的生理需求，但在HFD 的條件下，Met 干預后肝臟維生素B12 水平發(fā)生下調的具體機制尚未展開深入研究。

綜上所述，短期Met干預HFD 誘導的肥胖合并2型糖尿病小鼠，可引起肝臟維生素B12 而非血清維生素B12 水平的下調，且肝臟而非血清中的維生素B12 水平與體重、肝重、血脂水平、空腹血糖、內臟脂肪組織重量和皮下脂肪組織重量等糖脂代謝指標呈負相關。這提示口服Met 治療2 型糖尿病的過程中可能導致機體肝臟維生素B12 的水平下降，而適當補充維生素B12對改善糖脂代謝紊亂可能獲益。