光動(dòng)力療法對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞殺傷效應(yīng)

廖潔梅,肖寶紅,郭彩宏,鞏秀珍,程兆忠,林存智

(青島大學(xué),山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科； 2 醫(yī)學(xué)院松山醫(yī)院綜合內(nèi)科)

肺癌是全球發(fā)病率及死亡率均居首位的惡性腫瘤，是癌癥病人死亡的主要原因[1]。肺癌按照其病理類(lèi)型可以分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)兩大類(lèi)，其中SCLC約占所有肺癌的15%[2]。SCLC惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，早期即可出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移，未進(jìn)行任何積極治療的病人，其5年生存率低于5%，平均總生存期僅為2～4個(gè)月[3-4]。多數(shù)SCLC病人在確診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，放化療成為主要治療手段。盡管SCLC對(duì)放化療敏感，但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的治療后部分病人會(huì)出現(xiàn)耐藥及腫瘤的擴(kuò)散，伴隨著不可避免的嚴(yán)重副作用[5]。血卟啉衍生物(HPD)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法(PDT)是一種溫和、相對(duì)安全的局部治療方法，因具有可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞、創(chuàng)傷小等特點(diǎn)，PDT在癌癥精準(zhǔn)治療方面展現(xiàn)了獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)，是目前惡性腫瘤輔助治療的新方法。研究表明，PDT對(duì)皮膚腫瘤、頭頸部腫瘤、基底細(xì)胞癌、乳癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等均有治療作用[6-9]。但目前關(guān)于PDT對(duì)SCLC作用的研究甚少，其效果及機(jī)制需要進(jìn)一步的研究，且SCLC的總體生存率低，探索新的治療方法顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同光敏劑濃度及不同功率密度的630 nm激光照射對(duì)人SCLC H446細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)及其作用機(jī)制，以期為肺癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株與主要試劑 人SCLC H446細(xì)胞，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。HPD購(gòu)自重慶華鼎現(xiàn)代生物制藥公司，細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自以色列Biolo-gical Industries公司，CCK8試劑盒購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，Hoechst 33258染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，AnnexinV-FITC和PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海愛(ài)必信生物有限公司。

1.1.2儀器 實(shí)驗(yàn)所用的LED-IB光動(dòng)力治療儀，由武漢亞格光電技術(shù)有限公司生產(chǎn)，輸出波長(zhǎng)為紅光(633±10)nm、藍(lán)光(417±10)nm、黃光(590±10)nm，輸出功率密度為紅光20～100 mW/cm2、藍(lán)光25～120 mW/cm2、黃光10～40 mW/cm2，工作方式為連續(xù)或脈沖。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) H446細(xì)胞常規(guī)用含100 kU/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素混合液、體積分?jǐn)?shù)0.10滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度增長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將H446細(xì)胞接種于5塊96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別加入HPD濃度為0、5、10、12、15、20 mg/L的培養(yǎng)液避光培養(yǎng)4 h后更換含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液，分別給予0、25、50、75、100 mW/cm2功率密度的630 nm激光垂直照射2 min，垂直距離9 cm，光斑直徑9 cm。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，加入100 μL含體積分?jǐn)?shù)0.10 CCK8的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用自動(dòng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取CCK8實(shí)驗(yàn)中篩選出來(lái)的最佳HPD-PDT參數(shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(無(wú)光敏劑，無(wú)激光照射)、單純光敏劑組(光敏劑濃度為15 mg/L，無(wú)激光照射)、單純光照組(無(wú)光敏劑，激光功率密度為50 mW/cm2)和HPD-PDT組(光敏劑濃度為15 mg/L，激光功率密度為50 mW/cm2)。經(jīng)上述處理24 h后收集細(xì)胞，調(diào)整至密度為109/L，離心后以PBS洗2次，加入500 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，按要求依次加入AnnexinV-FITC和PI染色劑各5 μL，室溫避光孵育5～15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取潔凈細(xì)胞爬片，用體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇浸泡10 min、PBS洗3次、培養(yǎng)液洗1次后置于12孔板內(nèi)，接種H446細(xì)胞后培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為空白對(duì)照組(無(wú)光敏劑，無(wú)激光照射)、單純光敏劑組(光敏劑濃度為15 mg/L，無(wú)激光照射)、單純光照組(無(wú)光敏劑，激光功率密度為50 mW/cm2)和HPD-PDT組(光敏劑濃度為0、5、10、12、15、20 mg/L，激光功率密度為50 mW/cm2)。進(jìn)行相應(yīng)處理避光培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL固定液，15 min后棄固定液并用PBS洗3次，每孔加入0.5 mL Hoechst 33258染色液染色5 min，棄染色液，以PBS洗3次，將一滴抗熒光猝滅劑滴在載玻片上，蓋上染色好的細(xì)胞爬片，室溫避光孵育15 min后于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-9mRNA的表達(dá)水平 分組及處理方法同1.2.4。處理24 h后每孔加入TRIzol 1 mL，靜置5 min 后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，加入三氯甲烷0.2 mL，振蕩混勻后離心；吸取上清至新的EP管中，加入與其等量的異丙醇；離心后棄上清，加入無(wú)水乙醇0.5 mL；離心后棄乙醇，檢測(cè)所提取的RNA濃度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作獲得cDNA，根據(jù)SYBR Green熒光定量試劑盒說(shuō)明以此cDNA為模板進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 HPD-PDT對(duì)H446細(xì)胞活力的影響

不同HPD濃度和光照強(qiáng)度下各組細(xì)胞存活率比較，光敏劑濃度(F=1 269.533,P<0.001)和激光功率密度(F=1 229.600,P<0.001)主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且二者存在交互效應(yīng)(F=78.430，P<0.001)。單獨(dú)給予光敏劑或者激光照射對(duì)H446細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用；HPD-PDT對(duì)H446細(xì)胞殺傷效應(yīng)隨著光敏劑濃度的增加和激光功率密度的增大而增大，當(dāng)激光功率密度為50、75、100 mW/cm2以及光敏劑濃度為15、20 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=663.385～807.743,P<0.001)。當(dāng)激光功率密度為50 mW/cm2、HPD濃度為15 mg/L時(shí)，HPD-PDT對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯，再增加激光功率密度或者光敏劑濃度細(xì)胞存活率無(wú)顯著變化(t=0.480～1.946，P>0.05)。因此，選取激光功率密度為50 mW/cm2和HPD濃度為15 mg/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

2.2 HPD-PDT對(duì)H446細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組、單純光敏劑組、單純光照組和HPD-PDT組的細(xì)胞凋亡率分別為(8.60±1.22)%、(11.99±0.21)%、(10.17±0.58)%和(59.67±2.36)%，4組整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 073.518，P<0.001)，HPD-PDT組與空白對(duì)照組、單純光敏劑組和單純光照組相比細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=62.612～65.612，P<0.001)。Hoechst 33258染色顯示，空白對(duì)照組、單純光敏劑組和單純光照組無(wú)明顯細(xì)胞凋亡，HPD-PDT組可見(jiàn)凋亡細(xì)胞染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核致密濃染，隨著光敏劑濃度的增加，凋亡細(xì)胞增多且細(xì)胞密度降低。見(jiàn)圖2、3。

2.3 HPD-PDT對(duì)H446細(xì)胞Caspase-9、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與各對(duì)照組相比較，HPD-PDT組H446細(xì)胞的Bax、Caspase-9mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)(F=445.426、1 765.177，P<0.05)，而B(niǎo)cl-2mRNA表達(dá)水平則明顯下調(diào)(F=171.193，P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖1 不同濃度HPD結(jié)合不同功率密度激光照射對(duì)H446細(xì)胞活力的影響

3 討 論

PDT是近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域的一種新型微創(chuàng)技術(shù)，該技術(shù)利用腫瘤組織對(duì)光敏劑選擇性攝入和濃集的特性，給予特定波長(zhǎng)激光照射，激發(fā)腫瘤組織中的光敏劑產(chǎn)生活性氧，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死及自噬等一系列過(guò)程，最終達(dá)到治療的目的[6,10]。光敏劑在正常組織中能迅速代謝，因此在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的損傷較小，不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重副作用，PDT因?yàn)榘邢蛐詮?qiáng)、微創(chuàng)、可重復(fù)進(jìn)行多次治療等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為癌癥治療的新手段。其抗腫瘤機(jī)制主要有如下幾點(diǎn)。①光敏劑吸收特定波長(zhǎng)的光后發(fā)生Ⅰ型和Ⅱ型光化學(xué)反應(yīng)，Ⅰ型光化學(xué)反應(yīng)即三重態(tài)光敏劑與底物分子間直接發(fā)生電子轉(zhuǎn)移或抽氫作用，產(chǎn)生自由基離子，并進(jìn)一步與周?chē)难醴磻?yīng)生成活性氧；Ⅱ型光化學(xué)反應(yīng)即三重態(tài)光敏劑轉(zhuǎn)移能量至基態(tài)氧，產(chǎn)生單態(tài)性氧。這些物質(zhì)與腫瘤細(xì)胞中的分子發(fā)生氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[11]。②PDT通過(guò)改變新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致新生血管血供減少，從而使之缺血、低氧而變性壞死，抗新生血管生成。③增強(qiáng)腫瘤免疫原性，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)[10]。本研究結(jié)果顯示，HPD-PDT處理后人SCLC H446細(xì)胞的存活率明顯降低，其殺傷效應(yīng)與HPD濃度和激光照射劑量密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，隨著光敏劑濃度和激光功率密度的增加而增大。

A：空白對(duì)照組；B：?jiǎn)渭児饷魟┙M；C：?jiǎn)渭児庹战M；D：HPD-PDT 組。

A：空白對(duì)照組；B：?jiǎn)渭児饷魟┙M；C：?jiǎn)渭児庹战M；D：HPD-PDT組(HPD為5 mg/L)；E：HPD-PDT組(HPD為10 mg/L)；F：HPD-PDT組(HPD為12 mg/L)；G：HPD-PDT組(HPD為15 mg/L)；H：HPD-PDT組(HPD為20 mg/L)。200倍。

A：空白對(duì)照組；B：?jiǎn)渭児饷魟┙M；C：?jiǎn)渭児庹战M；D：HPD-PDT組(HPD為5 mg/L)；E：HPD-PDT組(HPD為10 mg/L)；F：HPD-PDT組(HPD為12 mg/L)；G：HPD-PDT組(HPD為15 mg/L)；H：HPD-PDT組(HPD為20 mg/L)。

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，可分為凋亡促進(jìn)因子和凋亡抑制因子，兩者的比值決定細(xì)胞是否能接受凋亡信號(hào)[12]。Bcl-2屬于抗凋亡因子，Bax屬于促凋亡因子，Bax通過(guò)與自身組成同源二聚體或者與Bcl-2組成異源二聚體，抑制Bcl-2的活性，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，HPD-PDT處理后的H446細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)水平明顯降低，而B(niǎo)axmRNA表達(dá)水平明顯升高，提示HPD-PDT可能通過(guò)改變Bax和Bcl-2異源二聚體平衡而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與GUO等[15]的研究結(jié)果(PDT導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)、Bax表達(dá)水平上調(diào))一致。Caspase家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶家族，其成員為存在于胞質(zhì)溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，可以選擇性地對(duì)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)進(jìn)行高效切割[16]。Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，Bcl-2家族成員Bax和Bak的激活導(dǎo)致細(xì)胞色素C(Cyt C)等促凋亡蛋白的釋放[17-18]，Cyt C結(jié)合Apaf-1形成凋亡小體并激活Caspase-9，活化的Caspase-9可以直接裂解并激活Caspase-3和Caspase-7，從而加速細(xì)胞凋亡[19-21]。本研究中H446細(xì)胞經(jīng)HPD-PDT處理后BaxmRNA表達(dá)增加，Bcl-2mRNA表達(dá)降低，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Caspase-9活化并激活下游Caspase-3和Caspase-7，完成對(duì)底物的切割，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PDT能明顯抑制人SCLC H446細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，呈光敏劑濃度與激光功率密度依賴性，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax和Caspase-9mRNA的表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2mRNA的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為PDT在肺癌中的臨床應(yīng)用提供了一定的理論支持。