烏司他丁對體外循環(huán)下心臟瓣膜置換術(shù)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞焦亡的影響

周一鳴，惠康祥，周俊輝，涂立剛*

0 引言

體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass，CPB)下心臟瓣膜置換術(shù)是目前治療心臟瓣膜病的主要方法，該術(shù)式已較為成熟，手術(shù)成功率高[1]。而CPB、手術(shù)操作刺激及缺血再灌注損傷等因素又可誘發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥，影響患者預(yù)后[2]。研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥復(fù)合體通路的激活參與機(jī)體多種生理病理過程[3]。在該通路被激活的過程中，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 (Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1)切割消皮素-D (Gasdermin-D，GSDMD)氨基端和羥基端的連接體，產(chǎn)生的N端片段(GSDMD-N)可靶向作用于細(xì)胞膜，增加質(zhì)膜的通透性，導(dǎo)致炎性細(xì)胞程序性死亡，即細(xì)胞焦亡[4]。外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)是外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，主要參與機(jī)體炎性反應(yīng)。作為一種非特異性蛋白酶抑制劑，烏司他丁(Ulinastatin，UTI)已廣泛用于心臟外科手術(shù)。研究表明，UTI抑制促炎細(xì)胞因子的生成并促進(jìn)抗炎介質(zhì)的釋放，減少肺損傷并改善CPB后的肺功能[5]。另一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，UTI在CPB手術(shù)中可抑制炎性細(xì)胞因子，縮短術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間和重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive Care Unit，ICU)駐留時(shí)間，有利于促進(jìn)患者康復(fù)[6]。本研究擬探討UTI對CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者圍術(shù)期炎性反應(yīng)和PBMCs焦亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究已獲本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者及其家屬簽署知情同意書。選擇于2020年2月至2021年5月入住本院和河南省胸科醫(yī)院的患者共60例，擇期行心臟瓣膜置換術(shù)，性別不限，年齡45～64歲，體重指數(shù)(Body mass index，BMI) 18～25 kg/m2，美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(American Society of Anesthesiologists，ASA)分級Ⅱ或Ⅲ級，紐約心臟病協(xié)會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級II或III級。排除標(biāo)準(zhǔn)：左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)<45%；近1個(gè)月內(nèi)發(fā)生心肌梗死；Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯；既往有心臟手術(shù)史；有糖尿病及過敏病史；近期有急性感染史；近期使用皮質(zhì)激素治療史；肝腎功能明顯異常。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為烏司他丁組(UTI組)和生理鹽水組(NS組)，每組各30例。

1.2 麻醉方法 患者入室后監(jiān)測心電圖、心率、脈搏血氧飽和度(Saturation of pulse oxygen，SpO2)及患者狀態(tài)指數(shù)(Patient state index，PSI)等，面罩吸氧，建立外周靜脈血管通路。Allen試驗(yàn)后，局麻下行橈動(dòng)脈穿刺置管術(shù)，監(jiān)測有創(chuàng)血壓。麻醉誘導(dǎo)：咪達(dá)唑侖0.04～0.06 mg/kg，舒芬太尼0.5～1.0 μg/kg，依托咪酯0.2～0.3 mg/kg，羅庫溴銨0.6～1.0 mg/kg，氣管插管術(shù)后行機(jī)械通氣，潮氣量 6～8 ml/kg，通氣頻率12～16 次/min，吸呼比=1∶2，吸入氧濃度(Fraction of inspired oxygen，F(xiàn)iO2) 40%～80%，維持呼氣末二氧化碳分壓(Partial pressure of end tidal carbon dioxide，PETCO2) 35～45 mmHg。維持麻醉：兩組患者均持續(xù)輸注丙泊酚4～12 mg/(kg·h)，吸入七氟烷1～1.3個(gè)最低肺泡濃度(Minimum alveolar concentration，MAC)，CPB期間停止吸入，間斷靜脈注射舒芬太尼 0.5～1.0 μg/kg、羅庫溴銨0.3～0.6 mg/kg，維持PSI值25～55。行右頸內(nèi)靜脈穿刺術(shù)及漂浮導(dǎo)管置入術(shù)，監(jiān)測中心靜脈壓及肺動(dòng)脈壓，連續(xù)監(jiān)測鼻咽溫與直腸溫，必要時(shí)采用輸液加溫以及醫(yī)用變溫毯等措施保溫。術(shù)中通過調(diào)整輸液，檢測血?dú)?、觀察尿量等方法，使用相應(yīng)藥物維持電解質(zhì)在合理范圍，維持出入量平衡及循環(huán)穩(wěn)定。手術(shù)在低溫和低流量的CPB下進(jìn)行。術(shù)畢保留氣管導(dǎo)管轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)室治療，并繼續(xù)機(jī)械通氣。術(shù)后應(yīng)用患者靜脈自控鎮(zhèn)痛(Patient-controlled intravenous analgesia，PCIA)進(jìn)行術(shù)后鎮(zhèn)痛，配方為舒芬太尼2.5 μg/kg、地佐辛0.5 mg/kg加生理鹽水稀釋至100 ml。參數(shù)設(shè)置：無背景劑量，速度為2 ml/h，患者自控鎮(zhèn)痛(Patient controlled analgesia，PCA)劑量0.5 ml，鎖定時(shí)間15 min。患者各項(xiàng)生命體征恢復(fù)，達(dá)到ICU拔管指征后，即拔除氣管導(dǎo)管，面罩吸氧?；颊吒黜?xiàng)生命體征平穩(wěn)，達(dá)到轉(zhuǎn)出ICU標(biāo)準(zhǔn)后，即轉(zhuǎn)入普通病房繼續(xù)治療。

1.3 藥物干預(yù) UTI組患者接受總劑量為20 000 U/kg的UTI，其中半量于手術(shù)切皮前輸注完畢，另一半劑量經(jīng)CPB管路給藥。NS組以等容量生理鹽水替代。

1.4 觀察指標(biāo) 麻醉誘導(dǎo)后切皮前 (T1)、CPB開始后30 min (T2)、CPB停止即刻 (T3)及停止后24 h (T4)時(shí)，采集頸內(nèi)靜脈血樣2 ml置于促凝管，再采集6 ml置于乙二胺四乙酸抗凝管，4 ℃冰箱保存，6 h內(nèi)處理。促凝管血樣1 000 g離心20 min，取上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；抗凝管血樣采用改良的Ficoll密度梯度離心法提取PBMCs，重懸于含12%胎牛血漿的1640培養(yǎng)液中，經(jīng)過夜誘導(dǎo)得貼壁PBMCs，刮取單核細(xì)胞用PBS制成細(xì)胞懸液，采用MoFloAstrios EQ流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)檢測單核細(xì)胞純度，其純度>90%，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-18及IL-1β的濃度。用Western blot法檢測PBMCs中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)，蛋白上樣量為30 μg，以目的蛋白條帶灰度值和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。記錄患者術(shù)中丙泊酚、舒芬太尼及去甲腎上腺素用量，術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間及ICU停留時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況比較 本研究共納入60例患者。UTI組術(shù)前取消手術(shù)1例，術(shù)后二次開胸止血1例，最終納入分析28例；NS組術(shù)后不同意繼續(xù)參與本研究1例，實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)，血樣污染，無法檢測指標(biāo)1例，最終納入分析28例。該56例患者均順利完成手術(shù)并出院。兩組患者一般情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般情況比較(n=28)

2.2 兩組患者術(shù)中資料比較 兩組患者術(shù)中丙泊酚、舒芬太尼、去甲腎上腺素用量及ICU停留時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間比較，UTI組較NS組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者術(shù)中藥物用量及術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間、ICU停留時(shí)間比較(n=28)

2.3 兩組患者血漿IL-18、IL-1β水平比較 與T1時(shí)比較，T2～T4時(shí)兩組患者血漿IL-18與IL-1β的濃度升高(P<0.05)；T2-T4時(shí)，UTI組患者血漿IL-18與IL-1β水平較NS組降低(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者血漿IL-18、IL-1β水平比較(n=28)

2.4 兩組患者PBMCs中NLRP3、Caspase-1、GSDMD水平比較 Western blot法檢測單核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)，見圖1。與T1時(shí)比較，T2～T4時(shí)兩組患者PBMCs中NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；T2～T4時(shí)，UTI組患者PBMCs中NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)水平較NS組降低(P<0.05)。見表4。

圖1 兩組患者NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)注：A.NLRP3蛋白；B.Caspase-1蛋白；C.GSDMD蛋白

表4 兩組患者PBMCs中NLRP3、Caspase-1、GSDMD水平比較(n=28)

3 討論

在該藥品使用說明書中，UTI初始劑量為每次25 000～500 000 U，每天1～3次。因此，UTI的用藥范圍較廣，安全性較高。本研究先從患者的安全考慮，再參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的用藥劑量[7]，確定UTI組患者接受總劑量為20 000 U/kg的UTI，其中的半量于手術(shù)切皮前輸注完畢，另一半的劑量經(jīng)CPB管路給藥。結(jié)果表明，未見UTI相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生。本研究中兩組患者術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間比較，UTI組較NS組降低，UTI有利于術(shù)后早期拔管，可能與其降低炎性反應(yīng)，減少肺部感染及對呼吸中樞的影響小等因素有關(guān)[8-10]。

正常人外周血中IL-18和IL-1β水平和活性都很低，當(dāng)機(jī)體受到刺激，上述炎癥因子的水平會增加，活性增強(qiáng)發(fā)生炎性反應(yīng)，因此，人外周血中IL-18和IL-1β的濃度可以反映機(jī)體炎性反應(yīng)的程度[11]。此外，IL-18和IL-1β是NLRP3炎癥通路的主要效應(yīng)分子，其濃度增高提示該通路的激活[12]。本研究顯示，NS組和UTI組患者IL-18和IL-1β水平與T1比較，在T2～T4時(shí)升高，提示患者在手術(shù)開始后，隨著CPB及手術(shù)操作等刺激，機(jī)體發(fā)生劇烈的炎性反應(yīng)。而UTI組患者在T2～T4時(shí)IL-18和IL-1β水平升高程度較NS組患者低，表明UTI在此類手術(shù)患者中發(fā)揮一定的抗炎作用。

研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有NLRP3表達(dá)，在炎癥感染和內(nèi)源性刺激作用下，其表達(dá)上調(diào)[13]。本研究顯示，兩組患者PBMCs中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示在此類患者中，NLRP3炎癥通路參與其炎性反應(yīng)機(jī)制，而UTI組患者NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)下調(diào)，提示UTI可以抑制該炎癥通路。這與李祥等[14]的研究結(jié)論一致。因此，UTI可以通過抑制NLRP3、Caspase-1的表達(dá)來減輕炎性反應(yīng)。

已有研究證實(shí)，GSDMD是Caspase-1誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵底物蛋白[15]。GSDMD蛋白在各種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等，它包含2個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域，N端具有在細(xì)胞膜上打孔的能力，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生；GSDMD-C端結(jié)構(gòu)域具有自體抑制功能，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，C端可抑制N端結(jié)構(gòu)域的功能[16]，而敲除GSDMD基因可抑制Caspase-1通路引起的炎性壞死[17]。本研究中的兩組患者PBMCs中均有GSDMD蛋白的表達(dá)，這是細(xì)胞焦亡參與其中的有力證據(jù)，而UTI組患者GSDMD蛋白表達(dá)水平較NS組患者低，提示UTI可能通過抑制PBMCs焦亡，發(fā)揮抗炎作用。本研究初步證實(shí)，UTI可通過下調(diào)PBMCs中GSDMD蛋白表達(dá)，抑制Caspase-1通路引起的炎性壞死。

綜上所述，UTI減輕了CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者的炎性反應(yīng)，其抗炎機(jī)制可能與抑制NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)、降低其下游炎癥因子IL-18、IL-1β的水平、抑制PBMCs焦亡有關(guān)。以上觀點(diǎn)出自單中心、小樣本臨床研究，尚待多中心、大樣本的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。