基于特征圖譜及一測多評法同時測定重樓藥材中9 種甾體皂苷的方法研究

白玉瑩，高 巖，賈天穎，王京昆，蘇 鈦，徐新房，王 璇，程水清，文 佳，李向日*

（1.中藥炮制研究中心/中藥品質(zhì)評價北京重點實驗室，北京 102488；2.北京同仁堂藥材參茸投資集團有限公司，北京 100035；3.北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，北京 102629；4.云南省藥物研究所，昆明 650111）

重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis (Franch.) Hara的干燥根莖。秋季采挖，除去須根，洗凈，曬干[1]。重樓藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，用于驚癰、搖頭弄舌、熱氣在腹中、癲癰、癰瘡、陰蝕、下三蟲、去蛇毒[2]。重樓應用歷史廣泛，距今已有兩千多年的歷史。

本實驗采集基原確定的重樓原藥材，野外采集云南重樓正品10 批，七葉一枝花正品7 批，對其建立特征圖譜和9 種指標性成分等內(nèi)在指標性成分含量測定方法，對其質(zhì)量進行評價。重樓飲片只需經(jīng)過凈制、切制的炮制加工即得，所以該方法對重樓藥材和飲片都適用，尤其是重樓飲片，切制后無法辨別真?zhèn)?。本研究對重樓藥材及飲片真?zhèn)蔚拇_定、安全有效使用及質(zhì)量標準的完善提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters 1525 高效液相色譜儀（Waters 1525系統(tǒng)，Waters 2487 紫外檢測器，Breeze 色譜工作站，美國 Waters 公司）、色譜柱（Agilent SB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）、十萬分之一電子天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)公司）、Sartorius 電子分析天平（上海嘉鵬科技有限公司，精度為0.000 1）。

1.2 試劑與試藥 乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；乙醇和甲醇均為分析純。

采集基原確定的重樓原藥材，野外采集10 批正品云南重樓（Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.），7 批正品七葉一枝花（Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara），經(jīng)中國科學院昆明植物研究所李恒研究員鑒定基原，現(xiàn)標本藏于云南省藥物研究所。其中編號1～10 為云南重樓，編號11～17 為七葉一枝花。

2 重樓特征圖譜方法的建立

2.1 特征圖譜相關條件的優(yōu)化 建立重樓飲片的特征圖譜，為此本實驗通過對特征圖譜的檢測波長選擇、梯度洗脫條件、供試品提取方法、提取溶劑、提取次數(shù)等相關條件進行篩選和優(yōu)化，其相關條件穩(wěn)定可控，可實現(xiàn)在測定重樓飲片特征圖譜的要求。

2.1.1 檢測波長的篩選 重樓內(nèi)80 %以上的成分為皂苷類成分，由于皂苷類成分屬于末端吸收，為保證特征圖譜基線的平穩(wěn)，出峰數(shù)，各色譜峰的分離情況。優(yōu)化篩選203 nm 和210 nm 中更適合特征圖譜采集的檢測波長。在203 nm 和210 nm 條件下，基線平穩(wěn)、各個峰分離度情況基本一致，因203 nm 條件下吸收值較高，故選擇檢測波長為203 nm。

2.1.2 梯度洗脫條件的優(yōu)化 重樓提取物化學成分種類較多，且不同成分之間極性差別較大，如果等度進行分離，不能達到預期分離效果，因此選擇進行梯度洗脫條件。優(yōu)化標準為色譜峰數(shù)分離度高、基線平穩(wěn)及分析時間盡可能縮短，經(jīng)過反復試驗得到了較理想的梯度洗脫條件。檢測波長為203 nm，流速為 1.1 mL/min，進樣量10 μL，以乙腈為流動相 A，0.1%磷酸水溶液為流動相B，洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫分離條件 %

2.1.3 特征圖譜 9 種成分峰的指認 特征圖譜建立過程中，以相關對照品的出峰時間為標準，共指認了可同時具備定量和定性條件的9 個指標性成分，9個指標性成分的分離度均大于1.5，其對稱因子均在0.95～1.05之間。因此本方法指認此9種成分為目標峰，見圖1，圖2。

圖1 樣品3 特征圖譜

圖2 標準品圖

2.1.4 提取方法的篩選 本實驗以9 種指標性成分的峰面積總和為評判對比標準，對比超聲提取和回流提取2 種方法。提取流程為取重樓粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移入95%乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流或超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補齊重量，濾過，置100 mL 旋蒸瓶中，40℃旋干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑，稀釋至刻度，搖勻，即得。按照梯度洗脫條件進樣10 μL，測得各指標成分色譜峰的峰面積，通過總峰面積對比發(fā)現(xiàn)超聲比回流提取效率更高，所以本實驗選擇超聲提取。

2.1.5 提取溶劑的篩選 本實驗以9 種指標性成分的峰面積總和為評判對比標準，優(yōu)選對比甲醇和95%乙醇2 種提取溶劑中，對重樓飲片提取效率高的提取溶劑。其提取流程為取重樓粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移入甲醇或95%乙醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用相應的溶劑補齊重量，濾過，置100 mL 旋蒸瓶中，40℃旋干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑，稀釋定容至刻度，搖勻，濾過，即得。按照梯度洗脫條件進樣10 μL，測得各指標成分色譜峰的峰面積，通過總峰面積對比發(fā)現(xiàn)甲醇提取樣品的總峰面積高于乙醇，所以本實驗選擇甲醇作為提取溶劑。

2.1.6 提取次數(shù)的篩選 本實驗以不同提取次數(shù) 9 種指標性成分的相應峰面積總和，占多次提取的總峰面積的比例。篩選出最佳的提取次數(shù)。

通過實驗數(shù)據(jù)可知，第一次提取樣品9 種指標性成分的峰面積占3 次總峰面積的86.64 %，第二次提取樣品9 種指標性成分的峰面積占3 次總峰面積的11.32%。第三次提取9 個指標性成分峰面積之和占3次總峰面積的2.04 %，小于總峰面積的3.0%，第二次提取已經(jīng)提取樣品完全，因此本方法的提取次數(shù)為2次。

綜上，供試樣品提取方法為取重樓粉末（過三號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲提取（功率500 W，頻率 40 kHz）2次，每次30 min，放冷，再稱重，加甲醇補齊重量，濾過，合并溶液置100 mL 旋蒸瓶中，40 ℃旋干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 特征圖譜方法學考察

2.2.1 穩(wěn)定性 以同一編號的供試樣品，制備樣品溶液，分別于制樣后 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和 24 h 分別進樣，按照梯度洗脫條件進樣 10 μL，測得各指標成分色譜峰的峰面積，樣品中9 種特征圖譜指認峰峰面積 RSD 值在 0.71%～1.54 %之間，表明供試品溶液在制備后24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 精密度 以同一編號的供試樣品，制備樣品溶液，連續(xù)進樣6 針，按照梯度洗脫條件進樣 10 μL，測得各指標成分色譜峰的峰面積，結果表明樣品中9 種特征圖譜指認峰峰面積RSD值在0.33%～1.48 %之間，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性 以同一編號的供試樣品，制備6 份樣品溶液，按照梯度洗脫條件進樣 10 μL，測得各指標成分色譜峰的峰面積，結果表明樣品中9 種特征圖譜指認峰含量測定值RSD 值在2.10%～3.00%之間，表明該方法的重復性良好。

2.3 重樓市售飲片特征圖譜采集

2.3.1 供試樣品制備 取重樓粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，過濾，重復以上流程2 次，合并溶液置100 mL 旋蒸瓶中，40 ℃旋干，甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 特征圖譜采集 分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。見圖3。

圖3 正品重樓特征圖譜采集數(shù)據(jù)

通過基原確定的重樓原藥材的特征圖譜采集情況可知，正品重樓飲片的內(nèi)在成分種類和含量差別不大，相似度較好。通過其特征圖譜可以反映飲片內(nèi)在質(zhì)量。

3 同時測定重樓9 種甾體皂苷成分含量測定方法的研究

在特征圖譜建立過程中，以相關對照品的出峰時間為標準9 種甾體皂苷的分離度均＞1.5，其對稱因子在0.95～1.05 之間，滿足定性定量要求。因此重樓9種指標性成分含量測定采用特征圖譜的液相色譜條件。供試品溶液制備條件同特征圖譜。

3.1 重樓飲片9 種指標性成分含量測定方法學考察

3.1.1 標準曲線考察 取對照品適量，配置成重樓皂苷 I、重樓皂苷 II、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷V、重樓皂苷VI、重樓皂苷VII、重樓皂苷 H、重樓皂苷 D 的對照品儲備液，使其濃度分別為2.104、1.984、2.172、3.084、0.353 6、1.988、2.112、0.37、1.64 mg/mL，取混合對照品溶液 0.00、0.625、1.250、2.500、3.750 mL 于5 mL 容量瓶中甲醇定容至刻度，按上述梯度洗脫條件，分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。以9 種甾體皂苷的進樣濃度（mg/mL）為橫坐標（X），響應峰面積（AU·min）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程。如表2 所示。

表2 標準曲線考察

3.1.2 穩(wěn)定性考察 同“2.2.1”特征圖譜項下穩(wěn)定性考察。

3.1.3 精密度考察 同“2.2.2”特征圖譜項下精密度考察。

3.1.4 重復性考察 同“2.2.3”特征圖譜項下重復性考察。

3.1.5 加樣回收率性考察 取已知含量的同一編號的供試樣品，精密稱取 0.25 g，精密加入等量的對照品，按照供試品溶液的制備項下供試品溶液制備方法平行制備6 份樣品溶液，測定9 個指標性成分的含量，計算加樣回收率，加樣回收率均在 95%～105%之間。符合定量分析要求。

3.2 重樓飲片9 種指標性成分含量測定

3.2.1 供試樣品制備方法 同“2.3.1”特征圖譜項下供試樣品制備。

3.2.2 對照品溶液的制備 取重樓皂苷I、重樓皂苷II、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷V、重樓皂苷VI、重樓皂苷VII、重樓皂苷 H、重樓皂苷 D對照品適量，精密稱定，取各對照品儲備液適量加甲醇配制呈上述9 種成分分別為 0.42、0.40、0.43、0.41、0.07、0.40、0.42、0.07、0.08 mg/mL 的混合溶液，即得。

3.2.3 梯度洗脫條件 同“2.1.2”特征圖譜項下梯度洗脫條件

3.2.4 含量測定 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。按外標一點法計算9 種的指標性成分的含量，見表3。

表3 9 種指標性成分含量測定（n =4） %

由以上含量測定數(shù)據(jù)可知，云南重樓所含皂苷多為薯蕷皂苷，七葉一枝花所含皂苷多為偏諾皂苷。含量測定結果表明，樣品1～10 中均未檢測出重樓皂苷Ⅵ，樣品11～17 中部分可檢測出重樓皂苷Ⅵ，但檢出量也較低。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，延齡草中重樓皂苷Ⅵ含量較高，而延齡草為重樓常見混淆品。因此，當市售重樓飲片中含有較高重樓皂苷Ⅵ時，提示可能摻入延齡草等偽品藥材[3]。

4 小結

文獻研究表明，重樓中含有甾體皂苷、黃酮苷、植物蛻皮激素、多糖、脂肪酸酯、肌酸酐、鞣質(zhì)、苯丙素類、單寧酸生物堿、氨基酸及微量元素等成分[4-9]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，重樓甾體皂苷具有抗腫瘤、抗炎抑菌、鎮(zhèn)靜止痛、止咳平喘、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗肺部纖維化等作用[10-16]。

重樓于《中國藥典》1977 年版開始收錄，于2005年版加入含量測定，限度為按干燥品計算，含重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ的總量，不得少于0.80%，后于2010 年版進行修訂，更改為按干燥品計算，含重樓皂苷Ⅰ，重樓皂苷Ⅱ，重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ的總量不得少于0.60%。研究表明，重樓皂苷Ⅵ的含量對重樓藥材是否符合限度標準并未造成影響，且當重樓藥材中含有較高重樓皂苷Ⅵ時，更應考慮重樓偽品延齡草的摻入等情況。目前，重樓皂苷Ⅵ對照品（20 mg）市場價格為1 000～3 000 元，考慮到成本及以上原因，建議中國藥典重樓藥材標準去掉重樓皂苷Ⅵ，保留重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ，但限度不變，仍為“總量不得少于0.60%”。目前，以上意見均已被《中國藥典》2020 版采納收錄。

近年來，重樓野生資源枯竭，因其種植培育周期長、存在風險等因素，重樓藥材及飲片的價格急劇增長，市場上摻仿現(xiàn)象頻發(fā)。因此，有必要建立多種成分同時測定的特征圖譜和含量測定方法，對重樓藥材和飲片的質(zhì)量進行有效質(zhì)量控制。為評價重樓市售飲片質(zhì)量現(xiàn)狀，本實驗對基原確定的17 批正品重樓藥材的內(nèi)在指標性成分進行了考察。為完善重樓內(nèi)在指標性成分的相關方法，本文建立了重樓的特征圖譜和9 種指標性成分同時進行含量測定的方法，所建立的方法操作簡便、結果準確穩(wěn)定，可用于重樓內(nèi)在指標性成分含量的檢測，同時也為重樓飲片的質(zhì)量評價及《中國藥典》重樓標準的修訂提供了理論依據(jù)。