銀杏葉提取物對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖犬脂肪沉積及脂質(zhì)代謝的影響

陸 江，盧勁曄，周紅蕾

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，江蘇泰州 225300）

犬的肥胖癥是由脂肪細(xì)胞肥大引起的，嚴(yán)重危害寵物犬的健康（郭世洪，2020）。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）可調(diào)控脂肪細(xì)胞分化與成熟（Lee等，2018），腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路可抑制脂肪酸合成（Mariangela等，2016），均與脂肪代謝有關(guān)。銀杏葉中富含多種活性成分，具有降壓、降脂、抗氧化等功效（王森等，2021）。但在脂肪沉積和脂質(zhì)代謝機(jī)制等方面的研究尚少，作用機(jī)制也不清晰。因此，本研究基于PPARγ與AMPK信號(hào)通路探討銀杏葉提取物對(duì)犬肥胖脂肪沉積和脂質(zhì)代謝的影響，為銀杏葉干預(yù)防治犬肥胖癥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料泰迪型貴賓犬，雄性，3歲，體重5.5 kg左右，飼養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院試驗(yàn)犬舍。銀杏葉提取物購(gòu)于泰州市中醫(yī)院。基礎(chǔ)飼糧（粗蛋白質(zhì)≥24.5%，粗脂肪≥13.0%，粗纖維≤5.0%）購(gòu)于上海比瑞吉寵物用品股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法30只貴賓犬（泰迪型）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成5組，分別為正常飼糧對(duì)照組（CD組）、高脂飼糧組（HFD組）、低劑量銀杏葉提取物組（LGL）、中劑量銀杏葉提取物組（MGL）和高劑量銀杏葉提取物組（HGL）。CD組飼喂基礎(chǔ)飼糧，HFD組飼喂高脂飼料（基礎(chǔ)飼糧+25%豬油），各銀杏葉提取物飲食組分別飼喂含1%、3%和5%銀杏葉提取物的高脂飼料，試驗(yàn)為期8周。試驗(yàn)結(jié)束后第2天空腹采血分離血清，然后麻醉，迅速取腹部皮下脂肪組織，部分保存于10%中性福爾馬林溶液，另一部分保存于液氮中，后轉(zhuǎn)移-80℃冰箱中保存。

1.3 體重及體脂率測(cè)定試驗(yàn)結(jié)束后用寵物電子稱測(cè)定犬的體重，用EchoMRI體成分分析儀測(cè)定體脂率。

1.4 血液生化檢測(cè)用試劑盒測(cè)定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，所有檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5 HE染色檢測(cè)皮下脂肪組織中脂肪細(xì)胞大小蘇木精-伊紅（H&E）染色如下：從福爾馬林溶液中取出樣品，脫水并包埋在石蠟中，脫水，包埋在石蠟中，HE染色，中性膠密封。在普通顯微鏡下觀察圖像并保存紀(jì)錄，使用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞橫切面面積。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)因子基因表達(dá)用TRIzol法提取脂肪組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。靶基因的引物序列根據(jù)已發(fā)表的Gen Bank設(shè)計(jì)（表1）。以 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因，PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s。每個(gè)樣本進(jìn)行3次平行，目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 PCR引物序列

1.7 western blot檢測(cè)脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)因子蛋白表達(dá)用RIPA裂解液提取皮下脂肪組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳2 h，PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。按1∶2 000加兔抗Ⅰ抗AMPKα1、ACC1、CPT-1、SREBP-1、FAS、PPARγ 和 GAPDH，置于4℃搖床中孵育過夜，TBST洗膜3次。加兔抗辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗（1∶5000）室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀中顯影成像。所有抗體均購(gòu)自Abcam公司。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J分析軟件對(duì)各組條帶的光密度值進(jìn)行分析，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉提取物對(duì)體重、體脂率及脂肪細(xì)胞大小的影響由表2可知，HFD組體重和體脂率均顯著高于CD組，MGL組和HGL組的體重和體脂率均顯著低于HFD組（P＜0.05），MGL組、HGL組脂肪細(xì)胞面積小于HFD組（P＜0.05）。

表2 銀杏葉提取物對(duì)體重、體脂率及脂肪細(xì)胞大小的影響

2.2 銀杏葉提取物對(duì)血脂代謝指標(biāo)影響 由表3可知，與CD組相比，HFD組TG、TC及LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著降低（P＜ 0.05）。與 HFD組比較，MGL組 TG、LDL-C及HDL水平與HFD組差異顯著（P＜0.05），HGL組TG、TC、LDL-C及HDL- C水平與HFD組差異顯著（P＜0.05）。

表3 銀杏葉提取物對(duì)血脂代謝指標(biāo)影響 mmol/L

2.3 銀杏葉提取物對(duì)脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響由表4可知，與HFD組比較，不同劑量銀杏葉提取物均顯著提升AMPK α1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；MGL組和HGL組的 ACC-1、SREBP-1、FAS及 PPARγ 的 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），CPT-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

表4 銀杏葉提取物對(duì)脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4 銀杏葉提取物對(duì)脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白含量影響由圖1可知，與HFD組比較，LGL組CTP-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)AS蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；MGL組和HGL組AMPK α1及CPT-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P ＜ 0.05），ACC1、SREBP-1、FAS及 PPARγ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖1 銀杏葉提取物對(duì)脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白含量影響

3 討論

研究表明，長(zhǎng)期的能量攝入大于消耗會(huì)造成脂肪大量沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖（Fu等，2016）。長(zhǎng)期攝入脂肪能量高飼料會(huì)引起肥胖，因此，高脂飲食是動(dòng)物肥胖癥造模的主要方法（Grant等，2011）。在本研究中，HFD組體重、體脂率及脂肪細(xì)胞面積顯著升高，表明高脂飼料是誘導(dǎo)犬肥胖的有效方法。給予銀杏葉提取物干預(yù)后可減輕脂肪細(xì)胞肥大，改善犬肥胖指標(biāo)。

AMPK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要通路。AMPKα1可通過抑制下游脂質(zhì)代謝相關(guān)酶ACC-1、FAS和SREBP-1的表達(dá)，發(fā)揮抑制脂質(zhì)合成作用（樸穎等，2022），還可激活下游分子脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶CTP-1的表達(dá)，促進(jìn)脂肪分解（單甄真等，2019）。本研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物可顯著上調(diào)AMPK α1和CTP-1表達(dá)，顯著下調(diào)ACC-1、FAS和SREBP-1表達(dá)。提示銀杏葉提取物可激活A(yù)MPK信號(hào)通路，減少高脂飲食誘導(dǎo)犬脂質(zhì)積聚。

PPARγ具有促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化成成熟脂肪細(xì)胞的作用，并可促進(jìn)脂滴的形成（Fu等，2018）。本研究中高脂飲食可顯著上調(diào)PPARγ的表達(dá)，銀杏葉提取物干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)PPARγ的表達(dá)。提示抑制PPARγ的表達(dá)，減少前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積也可能是銀杏葉提取物的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

銀杏葉提取物能改善犬的肥胖癥狀，降低血脂，減少脂肪組織脂質(zhì)沉積。其作用機(jī)制可能與銀杏葉提取物激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制PPARγ信號(hào)通路有關(guān)。