同位素稀釋-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留

楊開智，索紋紋，梁 丹，劉伶俐，萬(wàn)譯文*

（1.常德市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南常德 415000；2.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410153）

氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）又名氟甲砜霉素，是一種新型化學(xué)合成酰胺醇類抗菌藥，對(duì)革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌及支原體有很強(qiáng)的活性，具有很強(qiáng)的抗菌能力（馮民等，2013），因其價(jià)格低廉、療效好，曾被廣泛用于動(dòng)物的疾病防治。氟苯尼考作為氯霉素的替代品被廣泛用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖中，水產(chǎn)品中氟苯尼考?xì)埩魡栴}也引起消費(fèi)者的擔(dān)憂，氟苯尼考經(jīng)代謝后形成多種代謝產(chǎn)物，但大部分以氟苯尼考和氟苯尼考胺的形式存在，GB31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，在水產(chǎn)品中，氟苯尼考最大殘留限量（氟苯尼考與氟苯尼考胺之和）為1000μg/kg（仲伶俐等，2021；李雅寧等，2020）。

飼料一般是獸藥添加的主要載體，對(duì)漁用飼料中，氟苯尼考及氟苯尼考胺的檢測(cè)能從源頭上進(jìn)行有效控制。目前氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺常用的檢測(cè)方法主要有4種，分別為酶聯(lián)免疫法（皮江一等，2021；劉智宏等，2010）、氣相色譜質(zhì)譜法（喬青青等，2021）、高效液相色譜法（馬文瑾等，2020；刁志祥等，2019）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（陳國(guó)等，2019；FEDENIUK等，2015；陳濤等，2020）。目前國(guó)內(nèi)對(duì)氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的研究主要涉及在雞蛋（曾勇等，2019）、雞肉（張鳳清等，2010）、豬肉（宋菲等，2021；陶晰晨等，2014）和水產(chǎn)品上（邵會(huì)等，2015；劉正才等，2015），對(duì)飼料中氟苯尼考和氟苯尼考胺同時(shí)測(cè)定的研究不多，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)單、同時(shí)測(cè)定漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法具有重要意義，以便對(duì)水產(chǎn)品食用飼料進(jìn)行有效監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源），AB Sciex公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；漩渦混勻儀，德國(guó)IKA公司；超聲波清洗器，昆山超聲波儀器廠；24孔氮吹儀，美國(guó)organomation公司；平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi（布奇）公司；精密電子天平，梅特勒—托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司。

氟苯尼考及氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.5%以上（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）；氘代氯霉素，CAP-D5（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）；氘代氟苯尼考胺，F(xiàn)FA-D3（天津阿爾塔科技有限公司）；乙酸乙酯、甲醇、正己烷均為色譜純（德國(guó)默克公司）；氨水，分析純（四川西隴化工有限公司）；固相萃取小柱（美國(guó)waters公司）；無(wú)水硫酸鈉，于450℃下灼燒6h后儲(chǔ)存于干燥器中備用；實(shí)驗(yàn)室用水均為屈臣氏蒸餾水。

1.2 樣品前處理準(zhǔn)確稱取粉碎后的飼料樣品2.0 g（精確至0.01 g）至50 mL離心管中，加入0.05 mL CAP-D5和FFA-D3內(nèi)標(biāo)溶液（濃度均為100 ng/mL），旋渦混勻，加入0.5 mL氨水和10 mL乙酸乙酯，渦旋混勻后超聲提取10 min，取出后于離心機(jī)8000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至加入5 g無(wú)水硫酸鈉的25 mL帶塞離心管中，樣品殘?jiān)^續(xù)加入0.5 mL氨水和10 mL乙酸乙酯后離心，合并2次提取液。取10 mL上清液于45℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸干。加入4 mL水溶解殘?jiān)靹蚝蟠齼艋?/p>

將上述溶解液轉(zhuǎn)移至混合陽(yáng)離子固相萃取小柱中（MCX，500 mg/6 mL），使用前依次用 5 mL甲醇和5 mL水活化，用8 mL水淋洗后抽干，用5 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液。在45℃水浴中氮吹至干，用1 mL甲醇-水（1：9，V：V）定容混勻后過0.2μm濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.3 色譜條件色譜柱為Capcell Pak ADME（100 mm×2.1 mm，2.7μm）；柱溫為40℃，進(jìn)樣量為5μL，流動(dòng)相A為0.05% 甲 酸 -2.0 mmol/L甲酸銨溶液；B為甲醇；采用液相梯度洗脫 程 序 為：0～ 1 min，95%A；1～ 3 min，95%A～ 60%A；3～ 4 min，60%A～ 30%A；3～ 4 min，30% A ～ 10%A；4～ 4.5 min，10%A～95%A，保持3 min。流速為300μL/min。

1.4 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子切換掃描；掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；噴 霧 電 壓 為 ESI+（4500V）、ESI-（-3500V）；離子源溫度（TEM）為350℃；射入電壓（EP）為 10 V ；離子源氣（GS）為50 psi，其他離子源參數(shù)見下表1。

表1 4種目標(biāo)物的MRM采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇及優(yōu)化

2.1.1 提取溶液的選擇 國(guó)內(nèi)對(duì)氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的提取采用乙腈和乙酸乙酯的較多（陳濤等，2020）。本文比較了乙酸乙酯-氨水和乙腈兩種提取液，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)極性強(qiáng)的乙腈提取效率好，但提取液含有大量脂肪、色素等大分子雜質(zhì)，提取液較渾濁，在凈化處理時(shí)容易堵塞固相萃取柱，且在濃縮后，瓶壁上有白色的脂肪等難以溶解的凝結(jié)物。氟苯尼考胺屬于堿性化合物，更易溶解于堿性溶液中，氨化后采用乙酸乙酯提取后提取液更澄清，且旋蒸過程中濃縮速度比乙腈快，因此，采用氨水堿化的乙酸乙酯進(jìn)行提取。

2.1.2 凈化方式及固相萃取柱的選擇 本文采用固相萃取的方式來(lái)進(jìn)行凈化，研究比較了中性氧化鋁柱、HLB柱、C18柱和混合陽(yáng)離子交換柱（MCX）對(duì)漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺的凈化效果和回收率。結(jié)果表明，采用HLB固相萃取柱對(duì)氟苯尼考胺保留效果較差，回收率只有26.2%，MCX柱對(duì)氟苯尼考胺的凈化效果最好，回收率達(dá)到90%以上，綜合考慮，本文采用MCX柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化。

圖1 不同SPE柱對(duì)氟苯尼考及氟苯尼考胺凈化回收率的影響

2.2 色譜條件的選擇及優(yōu)化試驗(yàn)比較了乙腈-水、甲醇-水和甲醇-2.0 mmol/L甲酸銨溶液（含0.05%甲酸）3種不同的流動(dòng)相。乙腈洗脫能力強(qiáng)，氟苯尼考胺屬于極性藥物，出峰時(shí)間極短，大概在1 min之內(nèi)出峰，不利于氟苯尼考胺的保留。當(dāng)采用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，氟苯尼考靈敏度和峰形較好，但氟苯尼考胺峰形不夠尖銳，保留不穩(wěn)定。在水相中加入揮發(fā)性電解質(zhì)甲酸銨并加入0.05%甲酸控制流動(dòng)相pH，采用合適的梯度洗脫程序，氟苯尼考及氟苯尼考胺峰形尖銳且對(duì)稱性好，增大了兩者離子峰的峰強(qiáng)度。因此，本文采用甲醇-2.0 mmol/L甲酸銨溶液（含0.05%甲酸）為流動(dòng)相梯度洗脫。如圖2所示。

圖2 空白飼料中5.0μg/kg氟苯尼考及氟苯尼考胺加標(biāo)樣品離子色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化采用同位素稀釋法進(jìn)行定量分析，選用氘代氯霉素作為氟苯尼考內(nèi)標(biāo)物，氟苯尼考及氘代氯霉素在ESI負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-，氟苯尼考胺及氘代氟苯尼考胺在ESI正離子模式下進(jìn)行掃描，形成準(zhǔn)分子離子[M+H]+。在正負(fù)離子不同模式下，通過對(duì)碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在二級(jí)質(zhì)譜掃描模式下選取離子豐度強(qiáng)、選擇干擾小的子離子作為定量離子，次強(qiáng)的子離子作為定性離子來(lái)滿足藥物分析確診的要求。經(jīng)過優(yōu)化后的各化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.4 方法線性范圍、檢出限及定量限吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0 mg/L），用經(jīng)過“1.3 樣品前處理”復(fù)溶后的空白基質(zhì)溶液稀釋，制得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為 5、10、20、50、100、200 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。通過空白飼料樣品標(biāo)準(zhǔn)加入方法處理后確定方法檢出限和定量限，方法檢出限的信噪比大于等于3，方法定量限的信噪比大于等于10，結(jié)果見表2。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 方法回收率與精密度在市場(chǎng)中購(gòu)買3種不同品牌的漁用飼料，采取標(biāo)準(zhǔn)添加方法，在空白樣品中加入低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，3個(gè)添加水平均做6個(gè)平行，同時(shí)做對(duì)應(yīng)的樣品空白和試劑空白，按1.3節(jié)所述條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，該方法回收率和精密度滿足分析方法確診要求，重現(xiàn)性好，適合漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留的測(cè)定。

表3 氟苯尼考及氟苯尼考胺在空白樣品中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs，n=6）

3 結(jié)論

本文通過對(duì)前處理?xiàng)l件、色譜條件及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法來(lái)測(cè)定漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量。方法采用同位素稀釋添加和基質(zhì)標(biāo)曲相結(jié)合的方式抑制基質(zhì)效應(yīng)對(duì)氟苯尼考胺的干擾，提高了方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。通過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法可全面、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留，為政府加強(qiáng)對(duì)飼料違規(guī)使用獸藥問題的監(jiān)管提供技術(shù)支撐。