日糧中添加黃芪多糖對(duì)壞死性腸炎肉雞Th17/Treg平衡和腸道菌群的影響

郭 懿

（濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濮陽 457000）

壞死性腸炎（NE）是由A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腸毒性疾病。壞死性腸炎的死亡率很高，發(fā)生急性疾病時(shí)死亡率高達(dá)50%，尤其是發(fā)生在雛雞階段，而慢性壞死性腸炎會(huì)顯著降低雞的生長性能，引起腸潰瘍、侵蝕等不利影響，嚴(yán)重影響家禽健康，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失（Mcdevitt等，2006）。輔助 T細(xì)胞 17（Th17）是促進(jìn)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性T細(xì)胞類型，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是與Th17細(xì)胞功能相反的一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。用coccidia攻擊的雞顯著增加了脾臟和盲腸扁桃體中Th17細(xì)胞的比例（Kim等，2019）。Th17/Treg細(xì)胞已在患有潰瘍性結(jié)腸炎的哺乳動(dòng)物中得到廣泛研究，但沒有關(guān)于感染壞死性腸炎的肉雞中報(bào)道過Th17細(xì)胞比例的變化。

黃芪多糖（APS）具有增強(qiáng)免疫和抗炎特性，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加4 mg/kg APS對(duì)受到脂多糖（LPS）攻擊的肉雞具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以逆轉(zhuǎn)LPS的負(fù)面影響，其包括每日體重增加，采食量減少，空腸上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量和絨毛高度的減少（Wang等，2015）。但在家禽中關(guān)于APS對(duì)Th17/Treg平衡影響的研究十分有限。腸道健康的雞不僅能提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，還能抵抗腸道病原菌的侵襲，減少因病死亡和并發(fā)癥造成的經(jīng)濟(jì)損失，是保證雞生長性能良好的關(guān)鍵因素（Ulluwishewa等，2011）。影響腸道健康的因素包括飲食、病原體、環(huán)境和管理。植物多糖可以逃避小腸的吸收，到達(dá)腸道后半部被微生物群發(fā)酵，通過微生物群依賴性發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、腸道屏障保護(hù)、抗氧化等活性，因此成為研究熱點(diǎn)（Liu等，2020）。在本研究中，我們探討膳食APS補(bǔ)充劑是否可能調(diào)節(jié)壞死性腸炎肉雞的細(xì)胞免疫和腸道菌群。

1 材料和方法

1.1 黃芪多糖本研究中使用的APS購自北京中心生物有限公司。APS是從黃芪中提取的。APS的純度為80%。APS的分子量通過LC-MS測(cè)定，范圍為8～160000道爾頓。根據(jù)北京中心生物有限公司推薦的最佳添加量，本研究中APS添加量為200 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和日糧使用2×2因子排列將240只AA肉雞（1日齡）隨機(jī)分為4組，分別是對(duì)照組（標(biāo)準(zhǔn)日糧）、黃芪多糖組（日糧添加200 mg/kg APS）、感染壞死性腸炎攻擊組（標(biāo)準(zhǔn)日糧）、感染壞死性腸炎攻擊組（日糧添加200 mg/kg APS）。每組各60只AA肉雞。根據(jù)國家研究委員會(huì)（NRC 2012）的建議，應(yīng)制定無藥物的玉米-豆粕型日糧，以滿足或超過肉雞的營養(yǎng)需求。使用雙層立體雞舍，整個(gè)實(shí)驗(yàn)遵循標(biāo)準(zhǔn)管理程序。雞可以自由獲得干凈的水和飼料。本試驗(yàn)為期31 d。

1.3 壞死性腸炎模型的建立第13日齡攻毒組肉雞經(jīng)口接種30倍劑量的球蟲IV減毒疫苗（佛山生物科技有限公司，中國佛山）。對(duì)照組同時(shí)口服1mL無菌PBS。攻毒開始前提前8 h斷料，連續(xù)攻毒7 d，攻毒組所有肉雞經(jīng)口接種1 mL新鮮制備的1×濃度的產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030濃度為109CFU/mL（中國獸藥控制中心，北京，中國）。對(duì)照組肉雞在同一時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)制飼喂等體積（1 mL）滅菌的巰基乙酸鹽液體培養(yǎng)基（FT，CM801，北京路橋科技有限公司）。

1.4 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生產(chǎn)性能 記錄肉雞13、25和31日齡的飼料用量和體重，計(jì)算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）。

1.4.2 流式細(xì)胞檢測(cè)血液中Th17細(xì)胞和Th17/Treg比例 采用翅膀內(nèi)側(cè)靜脈采血。血液加入肝素抗凝血Th17細(xì)胞以CD4 PerCP-Cy5.5和RORγt PE-A標(biāo)記，Treg 細(xì)胞以CD25 FITC-A和 FoxP3 APC-A標(biāo)記。分別加入抗體室溫避光孵育15 min，加入500μL Lysing Solution 輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，加入1.5 mL PBS 緩沖液，以2500 r/min離心10 min，棄上清后加入PBS緩沖液輕輕混勻，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.4.3 盲腸微生物計(jì)數(shù) 無菌條件下采集感染后2和8 d的肉雞盲腸標(biāo)本，液氮快速冷凍。具體方法如下：將盲腸置于冰上（約4℃）解凍，在潔凈工作臺(tái)上用天平稱取0.3 g，置于5 mL無菌離心管中。然后將0.3 mL上清液移至無菌離心管中，用無菌生理鹽水進(jìn)行 102、103、104、105、106、107的梯度稀釋，將來自每個(gè)稀釋管的100μL溶液接種到相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上，并將平板鋪開直在溶液培養(yǎng)基上干燥。選擇30～300個(gè)菌落進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。GLM過程用于統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)交互作用顯著時(shí)采用單因素分析，采用Duncan′s法進(jìn)行多重比較。P＜0.05表示差異顯著，0.05＜P＜0.10表示具有一定的趨勢(shì)。

圖2 日糧中添加黃芪多糖對(duì)壞死性腸炎肉雞外周細(xì)胞免疫功能的影響

2 結(jié)果

2.1 對(duì)生長性能的影響由圖1可知，在第13天和第25天，各組肉雞體重?zé)o顯著差異。與對(duì)照組相比，第31天時(shí)，APS添加組體重顯著增加420 g（P ＜ 0.05）（圖1A）。 在 13～ 15 d APS組體重變化顯著增加50 g（P＜0.05）（圖1B）。與對(duì)照組相比，在第25～31天，補(bǔ)充APS可以顯著增加平均采食量42 g（圖1C），此外，日糧添加APS減輕了NE對(duì)生長性能的負(fù)面影響，并且顯著增加了13～25 g和25～31 d的飼料轉(zhuǎn)化率（P ＜ 0.05）（圖1D）。

圖1 日糧添加黃芪多糖對(duì)壞死性腸炎肉雞生長性能的影響

2.2 對(duì)外周細(xì)胞的免疫功能的影響分別在第25天和第31天檢測(cè)Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及Th17/Treg細(xì)胞比例。Treg細(xì)胞比例在第25天和第31天各組別無顯著差異。與未受NE攻擊的雞相比，NE攻擊的雞在第25天時(shí)外周血中Th17細(xì)胞比例顯著增加8%（P＜0.05），第25天Th17/Treg細(xì)胞比例顯著增加0.39%（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，日糧添加APS顯著降低4%的第25天時(shí)外周血中Th17細(xì)胞比例（P＜0.05），在攻毒組中，日糧添加APS顯著下調(diào)了25日齡Th17/Treg細(xì)胞比例（P＜0.05）。

2.3 盲腸微生物群檢測(cè)用培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測(cè)盲腸中產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌的含量。結(jié)果表明，與未攻擊的雞相比，NE攻擊的雞在第31天盲腸中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量顯著增加1.2 CFU/g（P＜0.05），乳酸桿菌的數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，日糧添加APS顯著降低了第31天盲腸中0.43 CFU/g的產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量（P＜0.05），乳酸桿菌的數(shù)量無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌的數(shù)量用培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測(cè)盲腸中的含量

3 討論

壞死性腸炎（NE）是一種由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腸毒性疾病[1]。該病多發(fā)生在2～5周齡的肉雞身上，死亡率為2%～10%，最高可達(dá)50%。Geier等（2010）研究表明，壞死性腸炎可以增加肉雞的料肉比、死亡率和腸道疾病，降低體重。生長性能下降的主要原因是球蟲引起蛋白質(zhì)（包括血漿）滲入腸腔，促進(jìn)產(chǎn)毒梭菌的快速繁殖和致病性，導(dǎo)致小腸消化吸收能力下降。據(jù)估計(jì)，家禽業(yè)每年由于壞死性腸炎造成的損失高達(dá)20億美元（Mcdevitt等，2006）。該實(shí)驗(yàn)觀察到 NE感染對(duì)肉雞體重增加有顯著的負(fù)面影響（Song等，2017）。補(bǔ)充APS可有效改善NE感染引起的生長性能下降。APS提高了雞的生長性能，對(duì)其他動(dòng)物的生長有積極影響，如豬，APS緩解了NE引起的生長性能下降，這可能是由于APS的直接抑菌作用減少了產(chǎn)氣莢膜梭菌，或調(diào)節(jié)了宿主免疫功能，達(dá)到殺菌和間接抑菌作用，從而減少腸道損傷和生長性能的損失。其次，研究發(fā)現(xiàn)NE感染增加了Th17細(xì)胞比率和Th17/Treg細(xì)胞比率。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌攻擊小鼠顯著上調(diào)脾臟和腸黏膜淋巴結(jié)中Th17和Treg 細(xì)胞的比例，上調(diào)腸黏膜淋巴結(jié)中RORα的 mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)mRNA和Foxp3的蛋白表達(dá)（Wang等，2017）。膳食補(bǔ)充APS可降低Th17/Treg細(xì)胞和Th17/IL-10細(xì)胞因子比例，緩解NE引起的全身炎癥。APS主要通過降低TLR4和NF-κB等基因的轉(zhuǎn)錄來緩解LPS誘導(dǎo)的雞的免疫應(yīng)激反應(yīng)（Liu等，2015）。我們推測(cè)這可能是由于APS可減輕腸道炎癥，改善腸道屏障，從而間接緩解全身炎癥。

4 結(jié)論

日糧添加APS減輕了NE對(duì)生長性能的負(fù)面影響，顯著降低了肉雞25日齡時(shí)血清中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比例以及31日齡肉雞盲腸中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量?？傊?，APS 可能通過調(diào)節(jié)腸道免疫、Th17/Treg平衡及腸道微生物群來減輕受到NE攻擊肉雞的腸道炎癥。