珍珠繡線菊葉斑病菌生物學(xué)特性及藥劑敏感性試驗

王睿寧劉吉王祿鑫王天奕范文忠

(1.吉林非常道農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司，吉林 長春 130000；2.吉林省雅酷園藝工程集團有限公司，吉林 長春 130115；3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101)

引言

珍珠繡線菊(Spiraea thunbergii Bl.)為薔薇科繡線菊屬，株高約1.5m的小灌木，分布日本、山東、陜西、遼寧、吉林等地，因其花期早、花朵密集，喜光、耐寒等特性，常被用作園林綠化林木，珍珠繡線菊作為生活小區(qū)的綠化植物，在吉林省大面積種植。近年來，在春季發(fā)現(xiàn)珍珠繡線菊葉斑病危害較重，受害葉片初期出現(xiàn)褪綠斑點，病斑邊緣有暈圈，中后期不規(guī)則形的暗褐色病斑，病斑多為1.0～3.0mm×1.5～2.0mm，極少數(shù)病斑在后期開裂，病斑多為單個危害，不融合。通過分子生物學(xué)技術(shù)及形態(tài)學(xué)鑒定確定該病害病原為鏈格孢屬(Alternaria ochroleuca)，確定為珍珠繡線菊鏈格孢葉斑病。通過對珍珠繡線菊葉斑病菌生物學(xué)特性以及藥劑敏感性研究，為防治奠定基礎(chǔ)，同時提供理論依據(jù)[1-3]。

1 材料和方法

1.1 供試材料

珍珠繡線菊葉斑病病菌菌種(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院植物病理實驗室)。

供試碳源：L-阿拉伯糖(L-Arabinose)、L-蘇糖(L-Threose)、甘露糖(Mannose)、葡萄糖(Glucose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(maltose)；供試氮源：硫酸銨((NH4)2SO4)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、尿素(CON2H4)；NaOH溶液、HCl溶液、75%酒精等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的分離與鑒定

在無菌條件下制作PDA培養(yǎng)基若干，采用組織分離法進行分離、純化病原菌。按照柯赫氏法則將獲得的病原回接至植株上，并獲得相近的病斑，然后再分離病原物，得到菌落均一穩(wěn)定的病原物，將病原菌送檢，根據(jù)DNA序列及病原形態(tài)，鑒定病原物的分類[4-7]。對病原菌rDNA ITS片段的PCR進行擴增和序列測定[8-10]，所有的擴增產(chǎn)物保存于4℃冰箱中，交由上海生工生物工程有限公司進行序列測定，確定病原分類地位。

1.2.2 病原菌生物學(xué)特性研究

1.2.2.1 不同溫度對菌落生長的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在126℃滅菌30min后取出，制作PDA培養(yǎng)基平板。無菌操作，打取直徑5mm菌餅，移入PDA培養(yǎng)基平板中央處。設(shè)5～35℃，設(shè)置為7個不同溫度恒溫培養(yǎng)，7個處理，重復(fù)4次，培養(yǎng)5d，十字交叉法測量菌落直徑[11-13]。

1.2.2.2 不同光照對菌絲生長的影響

設(shè)24h黑暗、24h光照、12h∶12h=黑暗∶光照；3個處理，4次重復(fù)。方法同上，測量菌落直徑。

1.2.2.3 不同碳源對菌絲生長的影響

以馬鈴薯半組合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；分別用等量碳源進行置換，碳源為L-阿拉伯糖(L-Arabinose)、L-蘇糖(L-Threose)、甘露糖(Mannose)、葡萄糖(Glucose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(maltose)，打取菌餅置于培養(yǎng)基中央，恒溫20℃培養(yǎng)5d，十字交叉法測量菌落的直徑。

1.2.2.4 不同氮源對菌絲生長的影響

以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用不同的氮源：硫酸銨((NH4)2SO4)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、尿素(CON2H4)取代等量的硝酸鈉，氮含量折算按3g·L-1進行計算，試驗共設(shè)氮源6個處理，重復(fù)4次；試驗方法同上。

1.2.2.5 不同酸堿度對菌絲生長的影響

無菌條件下制作PDA培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為5、6、7、8、9、10；6個處理，4次重復(fù)，試驗及測量方法同上。

1.2.2.6 不同溫度對孢子萌發(fā)的影響

配制2%麥芽糖孢子懸浮液，采用玻片萌發(fā)法，設(shè)5～35℃，不同溫度設(shè)置7個處理，重復(fù)4次，恒溫培養(yǎng)，每1h鏡檢1次孢子萌發(fā)率，連續(xù)3次至孢子不再萌發(fā)為止。

1.2.2.7 光照對孢子萌發(fā)的影響

設(shè)24h黑暗、24h光照、12h∶12h=黑暗∶光照；3個處理，4次重復(fù)。采用玻片萌發(fā)法，25℃恒溫暗培養(yǎng)，測定孢子萌發(fā)率，方法同上。

1.2.2.8 不同碳源對孢子萌發(fā)的影響

配制2%以L-阿拉伯糖(L-Arabinose)、L-蘇糖(L-Threose)、甘露糖(Mannose)、葡萄糖(Glucose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(maltose)碳源孢子懸浮液，6個處理，4次重復(fù)，采用玻片萌發(fā)法，25℃恒溫暗培養(yǎng)，測定孢子萌發(fā)率，方法同上。

1.2.2.9 不同氮源對孢子萌發(fā)的影響

選擇不同的氮源，氮含量折算按3g·L-1進行計算，配制硫酸銨((NH4)2SO4)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、尿素(CON2H4)不同的氮源孢子懸浮液，6個處理，4次重復(fù)，采用玻片萌發(fā)法，25℃恒溫暗培養(yǎng)，測定孢子發(fā)率，方法同上。

1.2.2.10 不同的酸堿度對孢子萌發(fā)的影響

調(diào)節(jié)pH值，設(shè)pH值為5、6、7、8、9、10，配制不同酸堿度的麥芽糖孢子懸浮液，6個處理，4次重復(fù)，采用玻片萌發(fā)法，20℃恒溫暗培養(yǎng)，測定孢子發(fā)率，方法同上。

1.2.3 不同藥劑對珍珠繡線菊葉斑病菌敏感性試驗

選取啶氧菌酯、肟菌酯、氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、吡唑醚菌酯、代森錳鋅、苯醚甲環(huán)唑、抑霉唑、醚菌酯、百菌清等10種殺菌劑原藥，每種藥劑用適量的助劑溶解，配制5～7個不同濃度的含藥培養(yǎng)基，重復(fù)4次，以清水為對照。

采用菌絲生長速率法，打取直徑5mm菌餅，移入PDA培養(yǎng)基平板中央處。設(shè)20℃恒溫培養(yǎng)5d，用十字交叉法測量菌落直徑[14,15]。參照Wadley法，測定供試殺菌劑原藥有效成分對菌絲的抑制率。利用最小二乘法建立“質(zhì)量濃度對數(shù)-幾率值”直線方程，用DPS7.05分析軟件求出各藥劑的毒力回歸方程和EC50。

抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100

毒力指數(shù)(TI)=對照藥劑EC50/處理藥劑EC50×100

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠繡線菊葉斑病癥狀描述

珍珠繡線菊葉斑病危害較重，受害葉片初期出現(xiàn)褪綠斑點，病斑邊緣有暈圈，中后期形成不規(guī)則暗褐色病斑，病斑多為1.0～3.0mm×1.5～2.0mm，極少數(shù)病斑在后期開裂，病斑單一，多為單個危害，病斑不融合。

圖1 珍珠繡線菊葉斑病危害癥狀

2.2 珍珠繡線菊葉斑病病原菌形態(tài)及鑒定

采集典型的病葉，利用組織分離法分離3種菌株，按照柯赫氏法則，接種病原菌于30個微傷葉片，獲取發(fā)病葉，對照不發(fā)病，對病葉再次分離純化后，獲得1種病原菌，所得病原菌落形態(tài)及孢子形態(tài)與最初分離的一致，另2個菌株未發(fā)病。病原菌落為圓形，初期顏色為灰白色，中后期灰色，菌絲稠密，氣生菌絲生長旺盛。通過分子生物學(xué)技術(shù)及形態(tài)學(xué)鑒定，確定病原為鏈格孢屬(Alternaria ochroleuca)。寄主為珍珠繡線菊(Spiraea thunbergii Bl.)。

圖2 分離的菌落形態(tài)及孢子形態(tài)

2.3 生物學(xué)特性研究

2.3.1 不同碳源對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

表1 不同碳源對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

由方差分析可知，適合菌絲生長、孢子萌發(fā)的碳源為麥芽糖。

2.3.2 不同氮源對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

表2 不同氮源對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

由方差分析可知，適合菌絲生長的氮源為硝酸銨；適宜孢子萌發(fā)的氮源為硫酸銨。

2.3.3 不同酸堿度對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

表3 不同pH值對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

由方差分析可知，pH為7時更適合菌絲生長、孢子萌發(fā)。

2.3.4 不同溫度對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

由表4可知，15℃更適合菌絲生長，20～25℃更適合孢子萌發(fā)。

表4 不同溫度對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

2.3.5 不同光照對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

由表5可知，病菌在全黑暗、全光照以及黑暗與光照交替條件下均能生長，12h∶12h=黑暗∶光照更適合菌絲生長、孢子萌發(fā)。

表5 不同光照對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

2.4 不同殺菌劑對珍珠繡線菊葉斑病的毒力

由表6可知，病菌對殺菌劑氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑敏感性最高，EC50值小于10mg·L-1；其次為肟菌酯，敏感性也較高，EC50值小于10.82mg·L-1；氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、肟菌酯毒力指數(shù)較高，可以有效抑制葉斑病菌的生長。

表6 不同殺菌劑對珍珠繡線菊葉斑病毒力

在生產(chǎn)中，可以優(yōu)先選用氟環(huán)唑等三唑類藥劑、肟菌酯等甲氧基丙烯酸酯類類殺菌劑，在發(fā)病初期交替使用，可以控制珍珠繡線菊葉斑病的發(fā)生。

3 討論與結(jié)論

3.1 結(jié)論

珍珠繡線菊葉斑病主要危害珍珠繡線菊，受害葉片初期出現(xiàn)褪綠斑點，病斑邊緣有暈圈，中后期呈不規(guī)則暗褐色病斑，病斑多為1.0～3.0mm×1.5～2.0mm，極少數(shù)病斑在后期開裂，病斑單一，多為單個危害，病斑不融合。通過珍珠繡線菊葉斑病病原菌形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定，確定珍珠繡線菊葉斑病病原為鏈格孢屬(Alternariaochroleuca)，明確了分類地位。通過生物學(xué)特性研究表明，適合菌絲生長、孢子萌發(fā)的碳源為麥芽糖；適合菌絲生長的氮源為硝酸銨；適宜孢子萌發(fā)的氮源為硫酸銨；pH為7更適合菌絲生長、孢子萌發(fā)；15℃更適合菌絲生長，20～25℃更適合孢子萌發(fā)；12h∶12h=黑暗∶光照更適合菌絲生長、孢子萌發(fā)。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，對病菌敏感的殺菌劑為氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、肟菌酯，可以有效抑制珍珠繡線菊葉斑病菌的生長。

3.2 討論

本文研究了10種殺菌劑對珍珠繡線菊葉斑病菌的敏感性，為有效控制病害的發(fā)生提供了理論依據(jù)；對于藥劑的田間使用及防治效果，還需要進一步進行試驗，對于不同種類殺菌劑交替使用及混合使用的聯(lián)合毒力等，需要進一步研究與探索。