褐菖鲉養(yǎng)殖密度與其eDNA的相關關系探討

高天翔 陳治 王曉艷 張浩博 史會來

(1.浙江海洋大學水產(chǎn)學院,舟山 316022;2.海南熱帶海洋學院水產(chǎn)與生命學院,三亞 572022;3.浙江海洋大學國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心,舟山 316022;4.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室,舟山 316021)

褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)屬鲉形目(Scorpaeniformes)、平鲉科(Sebastiae)、菖鲉屬(Sebastiscus)。褐菖鲉作為暖水性底層魚類,生活在近海底層巖礁地帶,廣泛分布于我國南北沿海近海巖礁海域,是典型的島礁定居性魚類[1]。春夏季分散在巖礁岸邊和島嶼四周覓食,冬季游向較深海區(qū)越冬。褐菖鲉是舟山島礁水域的優(yōu)勢魚種,同時也是主要的海洋捕撈及海釣對象[2,3],具有較高的經(jīng)濟價值。

環(huán)境DNA(Environmental DNA,eDNA)是生物體釋放于冰芯、土壤、空氣、水體、底泥等環(huán)境中的DNA總稱。eDNA分析是一種從環(huán)境樣品中提取所有的DNA片段,然后通過相應的DNA檢測技術進行目標生物的定性和定量分析的新工具[4—10]。該方法最早出現(xiàn)于20世紀80年代[11],主要被應用于微生物生態(tài)學研究[12—14]。近十年來,隨著樣品采集、DNA提取和DNA測序分析等關鍵技術的突破,環(huán)境DNA分析技術日漸成熟。其應用從微生物分析擴展到高等水生或半水生物種鑒定乃至生物群落的多樣性分析,目前已在生物入侵防治、瀕危物種保護、生物多樣性評價及重要資源監(jiān)測評估等方面發(fā)揮重要作用[15—17]。

褐菖鲉的研究主要集中在早期發(fā)育、苗種生產(chǎn)及生物學特征、生理生化及遺傳學方面[18—24]。國內(nèi)外尚未見褐菖鲉eDNA方面的研究報道。本文通過設計褐菖鲉特異性引物及Tanqman探針,進而建立褐菖鲉養(yǎng)殖密度與其eDNA濃度之間的相關關系,為基于eDNA技術的褐菖鲉生物量評估奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 褐菖鲉選取

實驗時間為2020年6月8日至2020年6月25日,在浙江省舟山市西軒島(29°53′41.45″ N,122°18′40.12″ E)養(yǎng)殖場開展研究。由于褐菖鲉個體暴露在空氣中掙扎強烈,影響體長、體重等生物學測定,因此先目測挑選個體基本一致的褐菖鲉個體,用直徑20 cm、孔徑0.2 cm、柄長1 m的魚撈將褐菖鲉撈入直徑1 m、水深10 cm的圓形水槽中。隨后用直徑10 cm、孔徑0.2 cm、把柄長28 cm的小型魚撈移入圓形水槽中,對個體略大和略小的個體進行再次篩選,以保證圓形水槽中剩余的褐菖鲉個體大小相近。隨機采集褐菖鲉個體,放入20 cm×20 cm×10 cm的塑料泡沫箱中(塑料泡沫箱中事先加入一定體積的水,防止褐菖鲉在泡沫箱中跳動,影響測重的準確性)。用量程為5 kg的天平秤量褐菖鲉的總重,取均值作為每尾實驗魚的重量。

1.2 室內(nèi)養(yǎng)殖實驗

取5個容積為1 m3、具有完備和相同換水裝置的圓形水桶,用10%次氯酸鈉充分消毒后,在水桶中加入0.5 m3海水(海水已進行多級沉淀、過濾和消毒)。每個水桶內(nèi)的水體更新速度恒定保持為3 L/min,多余水體從溢流管流出,使體積保持不變,直到實驗結(jié)束。分別在這5個水桶中加入2、4、8、16和32尾均重為12.46 g的褐菖鲉,在充分供氧條件下,統(tǒng)一喂食一定數(shù)量的蝦。在加入褐菖鲉0、8h、16h、1d、1.5d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d及10d后,對每個水桶采集250 mL水樣,共取平行樣3組,同時取250 mL純凈水作為空白對照組。采樣前用濃度為0.1%的次氯酸鈉溶液對采樣的玻璃瓶進行消毒處理。室內(nèi)溫度穩(wěn)定保持在(26±2)℃,保證養(yǎng)殖環(huán)境的穩(wěn)定適宜。

1.3 室外養(yǎng)殖試驗

對3個室外養(yǎng)殖池[水體體積約為:40 m(長)×15 m(寬)×0.3 m(高)=180 m3]進行充分消毒,分別在3個養(yǎng)殖池內(nèi)投放20、40和80尾褐菖鲉。分別抽取放入褐菖鲉0、8h、16h、1d、1.5d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d及10d后的養(yǎng)殖池水樣2L,共取3組平行樣,空白對照及消毒方式與室內(nèi)養(yǎng)殖實驗相同。

1.4 DNA 提取及 PCR擴增驗證

采用苯酚-氯仿方法從褐菖鲉肌肉中提取DNA[25]。使用硬骨魚類COI通用引物F1(5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′)、R1(5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′)[26]進行PCR擴增,反應體系為:DNTPs 2 μL(2.5 μmol/L),10×buffer(含Mg2+)2.5 μL,rTaq0.15 μL(5 U/μL),上下游引物各1 μL(10 μmol/L),DNA模板1 μL(50 ng),無菌水補齊總體積至25 μL。反應程序:95℃ 預變性5min;40次循環(huán)過程為：95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,最終在72℃延伸10min后于4℃保存。PCR產(chǎn)物質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳法來檢測,使用DL DNA Marker (TaKaRa),挑選電泳條帶單一且最為明亮的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進行雙向測序。測得的序列使用SeqMan軟件進行拼接、比對及人工手動校對,得到褐菖鲉的標準COⅠ片段。

1.5 褐菖鲉特異性引物和Taqman探針設計

用Clustal(version 2.0.11)、DNAMAN、Primer-Express 3.0.1及NCBI在線引物設計工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/),通過對比褐菖鲉與其他5種舟山海域出現(xiàn)的近緣魚種:許氏平鲉(Sebastes schlegelii)、三色菖鲉(Sebastiscus tertius)、裸胸鲉(Scorpaena izensis)、單指虎鲉(Minous monodactylus)和日本鬼鲉(Inimicus japonicus)的COⅠ基因片段序列,設計褐菖鲉特異性引物和TaqMan探針?；谠O計好的引物與探針使用K2P模型構(gòu)建NJ樹計算褐菖鲉與其他5種近緣魚種的種間遺傳距離。各魚種信息見表 1。

表1 褐菖鲉及其近緣種樣品信息Tab.1 Sampling information of S.marmoratus and its relative species

1.6 特異性引物和TaqMan探針的驗證

使用普通P C R 驗證引物的可行性,并用7300Plus Real-Time PCR儀檢測引物和探針的特異性。熒光定量PCR擴增體系為:TaqMan? Fast qPCR Master Mix(Applied Biosystems?) 10 μL、正反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)、DNA模板2 μL (50 ng)、探針0.4 μL (10 μmol/L)、無菌水補齊至20 μL。熱循環(huán)條件:50℃孵育2 min進行UNG酶激活,95℃預變性2min,45次循環(huán)過程為95℃變性30s,60℃退火/延伸30s。驗證用到的魚種見表 1。

1.7 褐菖鲉eDNA 提取及數(shù)字定量PCR擴增

對1.2和1.3采集的250 mL和2 L水用直徑47 mm,孔徑0.45 μm的醋酸纖維素濾膜(上海興亞)抽濾,分別抽濾等體積的純凈水作為陰性對照。用DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒進行eDNA提取,使用QuantStudio 3D數(shù)字PCR(Digital PCR,dPCR)進行褐菖鲉eDNA濃度的測定。

1.8 eDNA 濃度計算

使用R軟件(version 4.0.3)“basicTrendline”包對不同分組間進行散點圖擬合,計算線性回歸方程、方差和相關系數(shù),同時進行顯著性t檢驗。使用Excel 2019繪制褐菖鲉eDNA濃度變化趨勢圖及生物量加倍時eDNA濃度的增長倍數(shù)雷達圖。

2 結(jié)果

2.1 褐菖鲉特異性引物和探針

通過比對褐菖鲉與其他5種近緣魚種COⅠ基因片段序列,設計的褐菖鲉特異性引物和探針位于褐菖鲉線粒體基因組6503—6575 bp,其中引物為:HF-6503:5′-ATTACCGCTGTCCTTCTCCTT-3′、HR-6575:5′-ACAATGCTTCTAACAGACCGGAA-3′,探針為:HPro-6524:FAM-TCTCCCTACCAG TTCTTGCTGCTGGCAT-TAMRA。褐菖鲉的引物、探針序列及與近緣魚種的堿基差異情況如圖 1所示,種間遺傳距離見表 2。

表2 褐菖鲉特異性引物、探針信息Tab.2 Information of specific primers and probe of S.marmoratus

圖1 褐菖鲉引物、探針序列與其近緣種堿基差異情況Fig.1 Nucleotide variation of primers and probe between S.marmoratus and its relative species

2.2 熒光定量PCR結(jié)果

以6種魚類的組織DNA為模板,進行引物探針的特異性驗證,結(jié)果顯示褐菖鲉的Ct值為20左右,其他5個近緣魚種均未檢出。由此證明設計的褐菖鲉引物和探針具有特異性。各物種qPCR所得的Ct值見表 3。

表3 基于熒光定量PCR的目標生物引物、探針特異性驗證結(jié)果Tab.3 The specificity of primers and probe of target species by qPCR

2.3 室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度變化情況

室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度具體變化趨勢見圖 2。褐菖鲉eDNA濃度前后變化明顯,48h后達到峰值,3d后較為穩(wěn)定,且與各自群體密度相對應。

圖2 室內(nèi)水體褐菖鲉eDNA濃度變化情況Fig.2 Variation trend of eDNA concentration of S.marmoratus in indoor tanks

2.4 室外養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度變化情況

室內(nèi)養(yǎng)殖條件下eDNA濃度具體變化趨勢見圖 3。eDNA濃度先減少,存在8h的檢測盲點,之后再次增加,72h后達到峰值。

圖3 室內(nèi)水體褐菖鲉eDNA濃度變化情況Fig.3 Variation trend of eDNA concentrations of S.marmoratus in outdoor ponds

2.5 室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度與其養(yǎng)殖密度之間的相關關系

將同一養(yǎng)殖密度下不同時間的數(shù)據(jù)進行整合,評估養(yǎng)殖密度與eDNA濃度之間的整體相關性(圖4a),擬合效果較差,相關性不高(R2=0.70)。因此將時間組分為釋放早期:0—4d(含前者不含后者)和穩(wěn)定期:4—10d(含這兩個點)兩個時間段,取兩個時間段內(nèi)的分子拷貝數(shù)分別進行相關性分析。結(jié)果顯示穩(wěn)定期的擬合效果更佳(圖4b),在該時間段內(nèi),室內(nèi)養(yǎng)殖條件下eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間呈顯著的線性相關,關系式為:Density (ind./m3)=6.094×10-5×eDNA concentrations (copies/L)-1.033,R2=0.96。

圖4 室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA與其養(yǎng)殖密度之間相關關系Fig.4 Correlation between eDNA of S.marmoratus and its culture density in indoor culture

2.6 室外養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度與其養(yǎng)殖密度之間的相關關系

室外數(shù)據(jù)整合與室內(nèi)數(shù)據(jù)方法一致,對養(yǎng)殖密度與eDNA濃度之間的整體相關性進行評估,結(jié)果顯示整體擬合效果較差(圖5a),相關性較低(R2=0.17)。同樣將時間組分為釋放早期:0—7d(含前者不含后者)和穩(wěn)定期:7—10d(含這兩個點)兩個時間段,取兩個時間段內(nèi)的分子拷貝數(shù)分別進行相關性分析。結(jié)果顯示穩(wěn)定期的擬合效果更佳(圖5b),在該時間段內(nèi),室外養(yǎng)殖條件下eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間呈顯著的線性相關,關系式為:關系式為:Density (ind./m3)=2.445×10-4× eDNA concentrations (copies/L)-0.123,R2=0.99。

圖5 室外養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度與其養(yǎng)殖密度之間相關關系Fig.5 Correlation between eDNA of S.marmoratus and its culture density in outdoor culture

2.7 室內(nèi)、室外養(yǎng)殖條件下,eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間關系的聯(lián)合分析

將室內(nèi)水桶和室外養(yǎng)殖池實驗結(jié)果聯(lián)合,進行eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度相關關系分析。結(jié)果表明整體與釋放早期擬合效果差、相關性低(圖6a),室內(nèi)室外在穩(wěn)定期的數(shù)據(jù)表明eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間呈線性相關關系(圖6b),關系式為:Density (ind./m3)=6.017×10-5× eDNA concentrations (copies/L) -0.485,R2=0.96。

2.8 褐菖鲉生物量加倍時 eDNA濃度的增長倍數(shù)

選取室內(nèi)組、室外組穩(wěn)定期數(shù)據(jù)探究褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時eDNA濃度增長倍數(shù)(表4和表 5)。室內(nèi)組在養(yǎng)殖密度由8 ind./m3增加到16 ind./m3時,eDNA濃度增長倍數(shù)較高,室外組養(yǎng)殖密度由0.22 ind./m3增加到0.44 ind./m3時,eDNA濃度增長倍數(shù)高。整體來看,室內(nèi)各小組eDNA濃度增長倍數(shù)(圖7)均高于室外小組(圖8),室內(nèi)組和室外組中eDNA濃度隨著褐菖鲉養(yǎng)殖密度增加而增加,但室內(nèi)組隨著養(yǎng)殖密度不斷增加eDNA濃度增加倍數(shù)趨于平緩。

圖7 室內(nèi)褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時eDNA濃度增長倍數(shù)Fig.7 Ratio of indoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

圖8 室外水體褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時eDNA濃度增長倍數(shù)Fig.8 Ratio of outdoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

表4 室內(nèi)褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時eDNA濃度增長倍數(shù)Tab.4 Ratio of indoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

表5 室外水體褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時其eDNA濃度增長倍數(shù)Tab.5 Ratio of outdoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

a.整體與釋放早期;b.穩(wěn)定期a.whole and early stage of release;b.stable stage

3 討論

3.1 特異性引物和探針設計

TaqMan探針法能夠保證在擴增過程中只對目標種進行特異性檢測[27,28]。本實驗通過對褐菖鲉及其近緣魚種進行同源序列比對,在序列變異較大的位置進行特異性引物探針設計,所得的引物、探針與近緣魚種序列皆存在一定數(shù)量的堿基差異。在引物探針的特異性驗證過程中,僅以褐菖鲉組織DNA為模板的樣品被檢測出,而以其他5種近緣魚種組織DNA為模板的樣品均未檢出,因此本研究設計的褐菖鲉特異性引物和TaqMan探針能保證擴增結(jié)果的特異性。

3.2 褐菖鲉eDNA定量檢測技術的高靈敏性

室內(nèi)條件下,不同養(yǎng)殖密度檢測到的eDNA在0—2d時間段內(nèi)呈上升趨勢,在2—3d內(nèi)褐菖鲉eDNA濃度回落,3d后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。在室外條件下,0—1d、1d—3d和3d—10d這3個時間段內(nèi),褐菖鲉eDNA濃度分別呈下降,上升和穩(wěn)定趨勢。室內(nèi)水桶及室外養(yǎng)殖池在“0”組的eDNA濃度極低,但并不為0。這與水母(Chrysaora pacifica)、鯉(Hypophthalmichthys molitrix)等物種定量檢測研究結(jié)果相一致[15,29]。塑料魚籠放入水桶的瞬間可能引起了水流波動,導致褐菖鲉eDNA能夠擴散到臨近水體中,致使dPCR結(jié)果為陽性。本實驗選用的褐菖鲉全部為幼魚,個體都比較小(12.46 g/尾);室外養(yǎng)殖池的水體體積也較大,最低密度組(0.11 ind./m3)中的褐菖鲉eDNA在釋放早期仍可被dPCR檢出。在不同時間段室內(nèi)組和室外組檢測的褐菖鲉eDNA濃度均有所不同,且差異較大,由此可以看出褐菖鲉eDNA定量檢測技術具有較高的靈敏性。

3.3 褐菖鲉eDNA濃度變化及“空白的8h”

無論是室內(nèi)水桶組還是室外養(yǎng)殖池組,褐菖鲉eDNA濃度的波動范圍都比較大。穩(wěn)定時期的褐菖鲉eDNA濃度大約比初始時期高1—2個數(shù)量級。對特定物種進行定量檢測時,應在預實驗中設置不同的采樣時間點,預先研究水體中eDNA濃度的穩(wěn)定情況。室內(nèi)和室外在實驗前期階段(eDNA釋放早期)的生物量評估結(jié)果較差,因此用于擬合分析的數(shù)據(jù)應選自eDNA穩(wěn)定釋放的時期,而結(jié)果也表明穩(wěn)定期的線性擬合效果好。在室外養(yǎng)殖組,褐菖鲉初始組(0)的eDNA濃度較高,這可能是因為室內(nèi)、室外水溫不一致,褐菖鲉由室內(nèi)轉(zhuǎn)移室外時會產(chǎn)生應激反應,皮膚黏液脫落等原因造成。但在0—1d組,水樣中的褐菖鲉eDNA濃度迅速降低;尤其是16h—1d時間段出現(xiàn)了eDNA濃度的“空白的8h”,dPCR也無法檢測到水體中的褐菖鲉eDNA。室外養(yǎng)殖池水質(zhì)較為清澈,褐菖鲉初始階段為躲避外界刺激可能游向水較深、離岸較遠的水池中央。褐菖鲉具有明顯的戀礁性[18,30]，靜止在養(yǎng)殖池中部的褐菖鲉可能不再發(fā)生游動。取樣處的褐菖鲉eDNA擴散或者降解后不再有新的褐菖鲉eDNA補充。反映在dPCR結(jié)果上,則是16h—1d階段內(nèi)褐菖鲉eDNA檢測為陰性。而1d后,水池中央的褐菖鲉eDNA開始擴散到養(yǎng)殖池外緣的水樣采集處。褐菖鲉eDNA才得以開始累積,直到最后穩(wěn)定下來。由此來看,戀礁行為可能會影響褐菖鲉eDNA擴散,“遠礁點”處存在eDNA檢測盲點。

此外,采樣點的設置對eDNA檢出和濃度估計是一個重要的因素。受室外條件限制,室外條件下的養(yǎng)殖池僅設置了一個采樣位點,這可能會導致檢出的eDNA濃度與實際有所偏差。水體eDNA的數(shù)量、質(zhì)量和穩(wěn)定性在很大程度上受到其在水中擴散的影響[31—33],室內(nèi)養(yǎng)殖水桶體積小,因此采樣位點對eDNA檢測影響較小。室外養(yǎng)殖池范圍較大,由于褐菖鲉的戀礁性會導致養(yǎng)殖池內(nèi)的eDNA分布不均勻,單一采樣位點難以保證采集到池內(nèi)均勻的eDNA,無法準確評估實際的eDNA濃度[36]。在自然環(huán)境中,水流、溫度、降水和紫外線等因素都會影響影響eDNA的降解[34—36],從而影響eDNA檢出與濃度估計。室外的環(huán)境因素往往無法控制,因此在難以保證養(yǎng)殖條件穩(wěn)定的情況下設置多個采樣位點對于eDNA的檢出和濃度的評估是非常有必要的。

3.4 在室內(nèi)和室外條件下,褐菖鲉eDNA與其密度相關關系

由于eDNA技術是基于生物體持續(xù)釋放到周圍環(huán)境的代謝物來分析和研究的[37,38]。在本研究中,隨著養(yǎng)殖密度增加,褐菖鲉eDNA濃度也呈增加趨勢,可見養(yǎng)殖條件下的水體eDNA能夠體現(xiàn)褐菖鲉密度,其相關關系為近海野外褐菖鲉資源定量監(jiān)測評估奠定了基礎。實際的野外采樣要選擇天氣情況良好且溫度適宜的時間段,以便采集到褐菖鲉eDNA釋放穩(wěn)定期的水樣,最能反映實際環(huán)境的褐菖鲉資源密度和數(shù)量。同時要盡可能增加采樣位點和重復采樣,避免產(chǎn)生檢測盲點導致假陰性的結(jié)果。