雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚消化代謝影響的初步研究

■顧祎鑫 張 立，2 代乾良 王文杰 魏艷超 張 正 韓雨哲 王 偉*

（1.大連海洋大學(xué)，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.鞍山裕豐飼料有限公司，遼寧 鞍山 114100）

隨著水產(chǎn)行業(yè)對全球經(jīng)濟(jì)的影響力持續(xù)擴(kuò)大，國際市場中水產(chǎn)行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益持續(xù)增加，以魚粉（fish meal，F(xiàn)M）為蛋白源的肉食性魚類飼料使用量正迅速增長。魚粉因其適口性好，蛋白質(zhì)含量高，富含維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，長期作為水產(chǎn)飼料中主要的蛋白質(zhì)來源。但隨著厄爾尼諾現(xiàn)象的發(fā)生以及全球人口數(shù)量的增長，魚粉的供應(yīng)量已經(jīng)不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求，我國水產(chǎn)配合飼料使用率僅10%的情況下已經(jīng)感到魚粉的稀缺，因此尋求新型優(yōu)質(zhì)蛋白源已成為國內(nèi)外學(xué)者在近年來關(guān)注的焦點。目前研究表明，家禽副產(chǎn)品粉（poultry by-product meal，PBM）作為新型的蛋白源在大菱鲆（Scophthalmus maximus）、大口黑鱸（Micropterus salmoides）、黑鯛（Acanthoparus schlegelii）以及石斑魚（Epinephelus coioides）等飼料中均可以一定程度上代替魚粉。家禽副產(chǎn)品粉是家禽屠宰后的下腳料經(jīng)提煉油脂粉碎后得到的產(chǎn)品。其中雞腸粉即屬于家禽副產(chǎn)品粉的一種，因其具有可用性、合理的價格和豐富的營養(yǎng)含量而逐漸受到關(guān)注。有研究認(rèn)為添加6%的雞腸粉可以很好地改善早期斷奶仔豬腸胃的健康。但在水產(chǎn)動物飼料中用雞腸粉代替魚粉的相關(guān)研究還比較少。

大瀧六線魚（Hexgrammos otakii）又名歐式六線魚，隸屬于鮋形目（Scorpaeniformes），六線魚科（Hexagrammidae）、六線魚屬（Hexgrammos）。為冷溫性近海底層巖礁魚類，在我國主要分布于遼寧、山東和江蘇等地，在日本及朝鮮半島也有分布。魚肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者喜愛，是中國北方養(yǎng)殖、增殖放流和資源修復(fù)的理想種類。目前大瀧六線魚的人工養(yǎng)殖技術(shù)日漸成熟，對其環(huán)境脅迫、毒理及病害的研究相對較多，而對蛋白質(zhì)需求的研究則相對較少。文章通過評估腸道消化酶、蛋白質(zhì)代謝酶活性以及3種調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量，分析飼料中雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚的影響。研究結(jié)果可為研制大瀧六線魚的配合飼料，合理開發(fā)利用雞腸粉這一新型蛋白源提供理論參考和數(shù)據(jù)支持。

1 材料方法

1.1 試驗飼料制備

以魚粉和雞腸粉為主要蛋白源，魚油和豬油為主要脂肪源配制成5 組等蛋白等脂的試驗飼料。其中雞腸粉代替飼料中40%魚粉的比例分別為0、25%、50%、75%、100%。分別標(biāo)記為A1、A2、A3、A4、A5組，其中A1 為對照組（僅含魚粉不含雞腸粉），所有飼料原料過60 目篩，按表1 配方稱量配制，混勻后經(jīng)制粒機(jī)制成1.5 mm顆粒，曬干后放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１?為試驗飼料氨基酸成分及含量。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

表2 試驗飼料氨基酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ)，%)

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗所使用的大瀧六線魚幼魚選自于遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室。挑選身體健壯、無疾病的375 條幼魚[平均初始體重為（1.58±0.06）g]隨機(jī)分配到15 個150 L 的聚乙烯水槽中（預(yù)先進(jìn)行消毒處理），試驗分為5組（A1～A5組），每組3個重復(fù)，每個重復(fù)25 尾。試驗前需用試驗飼料馴化約1 周的時間，在為期8周的飼養(yǎng)試驗期間，每天進(jìn)行兩次（9：00和16：00）投喂，表觀飽食。每天換水1次，換水量在1/3～1/2。水溫（17±2）℃、鹽度25～31、pH為（7.7±0.5）、溶解氧（6.3±0.5）mg/L、氨氮含量小于0.1 mg/L。

1.3 樣品的收集與測定

取樣前將試驗魚停食24 h后，用100 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（ms-222）麻醉魚體并于冰上進(jìn)行無菌解剖，每組隨機(jī)挑選8尾魚取腸道和肝臟，樣品存于-80 ℃冰箱中。每組選取12尾魚尾部采血，血液在4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，取上清液存于-80 ℃冰箱中。腸道用于消化酶測定，肝臟、血清用于蛋白質(zhì)代謝酶以及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對表達(dá)量的測定。

腸道胃蛋白酶（Pepsin，PEP）、α-淀粉酶（α-Amylase，α-AMS）、脂肪酶（Lipase，LPS）以及蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，GPT）活性測定的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 實時熒光定量PCR分析

使用Trizol法提取樣品肝臟RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)Primer 5.0軟件設(shè)計脂質(zhì)代謝相關(guān)基因過氧化物酶增殖激活受體γ（PPARγ）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）的特異性引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成（見表3），以β-actin為參照基因。

表3 引物信息

熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，上、下游引物各0.6 μL，2×Talent qPCR PreMix 10 μL、cDNA模板1 μL和RNase-Free ddH2O 7.8 μL 加入96 孔板中，離心后放入Roche PCR儀中開始分析。擴(kuò)增條件為：95 ℃條件下預(yù)變性3 min；95 ℃條件下變性5 s，60 ℃條件下退火15 s，進(jìn)行40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，取3次重復(fù)的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19 軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較分析各處理組間顯著性，P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚腸道消化酶活性的影響（見表4）

表4 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚腸道消化酶活性的影響

由表4可知，隨著雞腸粉代替魚粉比例提高可以不同程度影響大瀧六線魚幼魚腸道消化酶的活性，且總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中胃蛋白酶活性在A3（50%）組時達(dá)到最大，A2（25%）組時脂肪酶活性顯著高于其他組（P＜0.05）。而α-淀粉酶活性隨雞腸粉代替水平的上升總體變化則不大（P＞0.05）。

2.2 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚肝臟、血液代謝酶活性的影響（見表5、表6）

表5 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚肝臟代謝酶活性的影響（U/g prot.）

表6 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚血液代謝酶活性的影響（U/L）

由表5、表6 可知，隨著雞腸粉代替魚粉的比例增加，大瀧六線魚幼魚的肝臟及血清中的GOT 和GPT 活性呈上升趨勢。其中肝臟中A4（75%）、A5（100%）組GOT 活性顯著高于A1（對照）、A2（25%）組，且GPT 活性顯著高于其他各組（P＜0.05）。血清中A5（100%）組GOT 活性顯著高于其他各組（P＜0.05），而GPT 活性在A4（75%）、A5（100%）組時呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。

2.3 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響（見圖1～圖3）

圖1 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚PPAR-γ基因相對表達(dá)量的影響

圖2 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚CPT-1基因相對表達(dá)量的影響

由 圖1～圖3 可 知，PPAR-γ與G6PD基 因 的mRNA 表達(dá)量和雞腸粉代替水平成正相關(guān)，其中PPAR-γ基 因 的mRNA 表 達(dá) 量 在A3（50%）、A4（75%）、A5（100%）組時顯著上調(diào)（P＜0.05），而G6PD基因的mRNA 表達(dá)量在A4（75%）、A5（100%）組時顯著上調(diào)（P＜0.05）。CPT-1基因的mRNA 表達(dá)量和雞腸粉代替水平呈負(fù)相關(guān)，在A4（75%）、A5（100%）組時顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖3 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚G6PD基因相對表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚腸道消化酶活性的影響

消化酶的活性直接說明了動物對其營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力，是衡量水產(chǎn)動物對飼料適應(yīng)性的方法之一。研究表明，攝入不同來源的蛋白質(zhì)可以影響動物消化酶的分泌。本試驗結(jié)果表明，雞腸粉代替一定量的魚粉時可以顯著提升胃蛋白酶和脂肪酶的活性，這與黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）、鱔（Monopterus albus）、吉富羅非魚（Oreochromis niloticus，GIFT strain）的研究結(jié)果相似。說明雞腸粉的部分代替魚粉會提高大瀧六線魚幼魚對蛋白質(zhì)的消化，增強了對飼料中蛋白質(zhì)的利用能力。不過也有一些研究表明，PBM部分代替魚粉會顯著降低大菱鲆胃蛋白酶的活性。PBM缺乏某些必需氨基酸（如蛋氨酸和賴氨酸）同樣可能導(dǎo)致一些魚類對其消化吸收能力降低。而作為衡量動物消化能力的另一個指標(biāo)淀粉酶可根據(jù)水解產(chǎn)物的構(gòu)型分為α-淀粉酶和β-淀粉酶，α-淀粉酶可以存在于各種極端環(huán)境下，常常存在于水產(chǎn)動物的消化系統(tǒng)之中。本試驗研究表明，飼料中一定量的雞腸粉代替魚粉不會影響腸道中α-淀粉酶的活性。Jalili 等（2012）研究表明，在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）飼料中運用PBM代替一定比例的魚粉同樣不會對其腸道中α-淀粉酶的活性產(chǎn)生顯著的影響。有研究表明，PBM 代替75%的魚粉時會顯著降低大口黑鱸腸道中α-淀粉酶的活性。除了必需氨基酸的缺乏之外，PBM質(zhì)量的高低，不同魚種的營養(yǎng)需求，飼料配方差異的存在都可能影響魚類對PBM消化吸收的能力。

3.2 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚血清、肝臟蛋白質(zhì)代謝酶活性的影響

作為兩種重要的轉(zhuǎn)氨酶，GOT與GPT主要存在于肝臟和血液之中，是評價肝臟功能代謝健康最重要的指標(biāo)之一。GOT 與GPT 活性的高低反映出了魚類蛋白質(zhì)代謝的狀態(tài)。近年來研究表明，在魚類飼料中添加不同種類的PBM 代替魚粉對水產(chǎn)動物肝臟、血液GOT 與GPT 的活性產(chǎn)生不同的影響。本試驗研究表明，隨著飼料中雞腸粉代替魚粉的比例增加會增加肝臟和血液中GPT與GOT的活性，當(dāng)代替比例＞75%時，GOT 與GPT 均顯著提高。肝臟中這兩種轉(zhuǎn)氨酶的活性較低，肝臟受到損傷時轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液導(dǎo)致活性增高，本試驗結(jié)果說明雞腸粉高比例代替魚可能會導(dǎo)致大瀧六線魚幼魚肝臟發(fā)生損傷。Robaina等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中PBM代替魚粉比例超過40%時GOT與GPT的活性顯著增強，說明飼料中一定比例的PBM代替同樣導(dǎo)致了大菱鲆肝臟發(fā)生損壞，與本試驗結(jié)果類似。而另外一些研究表明，PBM代替60%的魚粉不會對黑鯛血液中GOT 與GPT 的活性產(chǎn)生顯著的變化。結(jié)果的差異可能是由于不同魚種生存環(huán)境、營養(yǎng)需求以及對PBM 的耐受性有關(guān)。因此，在PBM 代替魚粉的同時，添加一些有助于肝臟健康的添加劑成為學(xué)者們關(guān)注的焦點。

3.3 雞腸粉代替魚粉對大瀧六線魚幼魚肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

飼料中氨基酸種類分為必需氨基酸和非必需氨基酸，作為必需氨基酸種類之一，蛋氨酸是機(jī)體代謝的甲基供體，對調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝起到重要的作用。研究表明，在草魚（Catenopharyngodon idella）飼料中添加蛋氨酸可使其肝胰臟脂質(zhì)含量降低26%～74%。因此，在飼料中添加蛋氨酸對魚類的脂質(zhì)代謝能力具有顯著的提高。然而，PBM相比魚粉，缺乏一些如賴氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸，因此缺乏蛋氨酸的雞腸粉在代替一定比例的魚粉時很可能造成魚體內(nèi)脂肪酸的堆積。近年來，脂質(zhì)代謝在不同EPA/DHA比例、蛋白質(zhì)水平以及脂肪酸添加劑等方面都有大量的研究，但在不同飼料蛋白源導(dǎo)致氨基酸不平衡的相關(guān)研究甚少。在本試驗中，在大瀧六線魚幼魚飼料中雞腸粉代替一定比例魚粉可能會導(dǎo)致飼料中蛋氨酸的不平衡，從而表現(xiàn)為調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝基因mRNA表達(dá)量相應(yīng)發(fā)生變化。

過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR）在動物肝臟內(nèi)存在大量表達(dá)。作為PPAR的下游基因，CPT-1是脂肪酸β氧化的限速酶，參與脂肪酸線粒體氧化，PPAR/CPT-1組成的信號通路共同調(diào)節(jié)動物肝臟內(nèi)的脂質(zhì)代謝。研究表明，通過調(diào)節(jié)CPT-1信號通路，可以改善大鼠肝臟代謝，減輕肝臟損傷。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼料中雞腸粉代替魚粉＞75%時使得CPT-1基因的mRNA 顯著下調(diào)。楊玉輝等（2019）發(fā)現(xiàn)蛋氨酸的限制使肥胖小鼠CPT-1基因顯著下調(diào)，蛋氨酸水平減少可降低肉雞肝臟中CPT-1mRNA表達(dá)量，上述結(jié)果均與本試驗的研究結(jié)果相似。PPAR-γ與G6PD均為參與脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。作為PPAR的一種亞型，PPAR-γ是脂肪代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子之一，直接參與脂肪代謝過程。當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因表達(dá)發(fā)生障礙，會引起肝臟中脂代謝的紊亂，導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生。本研究表明，雞腸粉代替魚粉＞50%時PPAR-γ基因的mRNA基因表達(dá)量顯著上調(diào)，說明高比例的雞腸粉代替魚粉導(dǎo)致蛋氨酸的缺失，從而造成大瀧六線魚幼魚肝臟脂肪酸堆積。張慶功等（2019）發(fā)現(xiàn)飼料中低水平蛋氨酸使得紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）肝臟中PPAR-γ基因的mRNA 顯著上調(diào)，與本試驗研究結(jié)果類似。肝臟中G6PD主要存在于動物胞質(zhì)內(nèi)，其活性的變化與肝臟脂肪酸合成的速度息息相關(guān)。其脂肪酸的合成提供了還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），作為供氫體維持谷胱甘肽（GSH）還原性，NAPDH用于脂肪酸和膽固醇的合成。本試驗研究表明，G6PDmRNA 表達(dá)量隨著雞腸粉代替魚粉比例的增大總體呈現(xiàn)上升的趨勢，在代替比例＞75%時顯著上調(diào)，G6PD高表達(dá)合成了更多NAPDH，導(dǎo)致脂肪酸的累積。不過也有研究表明，G6PD表達(dá)量相對過低也可能造成肝臟DNA 損傷、細(xì)胞凋亡率增高。由此看來，抑制脂肪酸氧化能力和脂質(zhì)合成能力的提高是引起其肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝能力下降的主要原因。在大瀧六線魚飼料中雞腸粉代替魚粉不高于50%時，CPT-1、PPAR-γ、G6PDmRNA 表達(dá)量都不會發(fā)生顯著的變化。因此，在飼料中雞腸粉代替魚粉的基礎(chǔ)上，添加適量的蛋氨酸等必需氨基酸對減少大瀧六線魚幼魚肝臟脂肪的沉積會有很大的幫助，相關(guān)內(nèi)容有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

綜上所述，在大瀧六線魚幼魚飼料中，雞腸粉代替魚粉＜50%時，對其腸道消化酶、蛋白質(zhì)代謝酶以及肝臟脂質(zhì)代謝均無不良影響。因此建議大瀧六線魚幼魚飼料中雞腸粉的適宜添加量為50%。