大黃素對免疫應激仔豬器官指數(shù)、血清生化指標以及血清抗氧化能力的影響

■楊 文 馬中華 侯曉曉 施力光 姬孟瑤 荀文娟*

(1.海南大學動物科技學院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，可誘導氧化應激和急性炎癥，導致各種病理生理損傷。LPS可以刺激免疫細胞產生過量的自由基，從而導致氧化應激，LPS還會降低動物機體抗氧化酶活性[1]，加劇氧化應激的影響。張海文等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在屯昌仔豬腹腔注射LPS會顯著降低肝臟中總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）活性。LPS 可以通過NF-κB通路，上調白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎細胞因子的表達[3]。促炎細胞因子水平顯著升高是機體發(fā)生炎癥的重要特征，過表達的促炎細胞因子會導致機體受到嚴重的免疫應激，損傷機體內的組織器官。

大黃素（Emodin，ED）是大黃、虎杖、何首烏等中藥的有效單體成分，化學名1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌，分子式C15H10O5，在臨床治療和生產實踐上被廣泛應用[4]。據(jù)報道，大黃素具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗腫瘤等多種生物學活性[5-7]。大黃素可以通過抑制NF-κB炎癥通路發(fā)揮抗炎作用[8]，此外，大黃素還具有顯著的抗氧化功效。研究表明大黃素能通過其抗氧化和抗炎活性緩解重癥急性胰腺炎[9]。馬春艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素或大黃素聯(lián)合芹菜素可降低自發(fā)性高血壓大鼠腎臟丙二醛（MDA）和血管緊張素Ⅱ含量，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性以減輕腎臟過氧化情況。然而，大黃素是否能緩解LPS誘導的斷奶仔豬免疫應激，還未見相關報道。

本試驗通過腹腔注射LPS 建立斷奶仔豬免疫應激損傷模型，通過在日糧中添加300 mg/kg 大黃素研究大黃素對免疫應激仔豬器官指數(shù)、血清生化指標以及血清抗氧化能力的影響，旨在為畜禽養(yǎng)殖中應對脂多糖誘導的斷奶仔豬免疫應激損傷以及大黃素作為飼料添加劑的推廣應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大黃素購于南京景竹生物科技有限公司，純度為98%；LPS溶液購于Sigma公司；血清生化指標測定中相關試劑購于北京丹大生物技術有限公司和南京建成生物工程研究所有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗氧化試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 試驗設計

試驗選取24頭胎次相近、健康狀況良好的28日齡三元雜交（杜×長×大）斷奶仔豬，隨機分為4 個組，每組6個重復，公母各半，每只仔豬均進行單籠飼養(yǎng)。對照組（CON）：飼喂基礎日糧，宰前腹腔注射無菌生理鹽水；大黃素處理組（ED）：飼喂基礎日糧+300 mg/kg ED，宰前腹腔注射無菌生理鹽水；LPS應激組（LPS）：飼喂基礎日糧，宰前腹腔注射100 μg/kg LPS；大黃素+LPS處理組（ED-LPS）：飼喂基礎日糧+300 mg/kg ED，宰前腹腔注射100 μg/kg LPS。試驗期21 d[11-12]，在第21天屠宰。試驗飼糧參照NRC（2012）營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成及其營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗在中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所畜牧研究基地進行。試驗期間，試驗動物自由采食及飲水，每天飼喂兩次，分別為7：00及17：00，所有仔豬飼養(yǎng)在環(huán)境衛(wèi)生良好的豬舍中，每天清掃和消毒豬舍，豬舍溫度控制在25～28 ℃。

1.4 樣品采集

試驗第21天屠宰全部仔豬，屠宰前空腹12 h。在注射LPS或生理鹽水4 h后，前腔靜脈采集血液樣本，室溫靜置至自然凝固后，用離心機以3 000 r/min離心5 min制備血清樣本，-80 ℃保存用于分析血清抗氧化指標及炎性細胞因子含量。注射LPS或生理鹽水6 h后屠宰所有仔豬，并迅速收集內臟，計算器官指數(shù)。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 器官指數(shù)

器官指數(shù)（g/kg）=臟器重（g）/活體重（kg）

1.5.2 血清生化指標測定

血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉氨酶（ALT）、肌酐（CRE）含量和堿性磷酸酶（ALP）的含量使用普朗PUZS-600b全自動生化儀測定，相關試劑購于北京丹大生物技術有限公司。血清中谷草轉氨酶（AST）的活性采用南京建成生物工程研究所有限公司研制的試劑盒測定，測定嚴格按照說明書操作完成。

1.5.3 血清抗氧化能力測定

血清的總抗氧化能力（T-AOC）、MDA 和微量還原型谷胱甘肽（GSH）含量以及GSH-Px、SOD、CAT 的活性采用南京建成生物工程研究所有限公司研制的試劑盒測定，測定嚴格按照說明書操作完成。

1.5.4 血清炎性因子的含量測定

血清中炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量測定采用酶聯(lián)免疫試劑盒，采購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，測定嚴格按照說明書操作完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經Excel 2019 軟件整理后采用SPSS 21.0 進行分析，結果用“平均值±標準誤”表示。所有數(shù)據(jù)利用單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan’s 法進行組間多重比較，以P＜0.05 為組間差異顯著性的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 大黃素對免疫應激斷奶仔豬免疫器官指數(shù)的影響（見表2）

表2 大黃素對免疫應激斷奶仔豬免疫器官指數(shù)的影響（g/kg）

由表2 可知，各處理組中斷奶仔豬的心臟、脾臟以及腎臟器官指數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。與CON 組相比，ED-LPS 組肝臟和肺臟器官指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與LPS 組相比，ED-LPS 組肝臟器官指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

2.2 大黃素對免疫應激斷奶仔豬血清生化指標的影響（見表3）

表3 大黃素對免疫應激斷奶仔豬血清生化指標的影響

由表3 可知，各處理組仔豬血清中TP、ALB 含量以及ALT、AST 活性無顯著性差異（P＞0.05）。與CON組相比，LPS組血清中CRE含量以及ALP活性顯著提高（P＜0.05）。與LPS 組相比，ED-LPS 組血清中ALP活性顯著降低（P＜0.05）。

2.3 大黃素對免疫應激斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響（見表4）

由表4 可知，各組仔豬血清中MDA 含量和SOD活性無顯著性差異（P＞0.05）。與CON組相比，LPS組血清CAT、GSH-Px 活性和GSH 含量顯著降低（P＜0.05），ED 組血清T-AOC 含量顯著提高（P＜0.05），ED-LPS 組血清CAT、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05），T-AOC 含量顯著升高（P＜0.05）。與LPS 組相比，ED-LPS 組血清CAT 活性、GSH 含量和T-AOC 含量顯著提高（P＜0.05）。

表4 大黃素對免疫應激斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響

2.4 大黃素對免疫應激斷奶仔豬血清炎性細胞因子含量的影響（見表5）

由表5 可知，各組中血清IL-1β含量無顯著性差異（P＞0.05）。與CON組相比，LPS組血清IL-6含量顯著提高（P＜0.05），而ED-LPS 組與CON 組無顯著差異（P＞0.05）。與ED 組相比，LPS 組血清TNF-α含量顯著提高（P＜0.05）。

表5 大黃素對免疫應激斷奶仔豬血清炎性細胞因子含量的影響(pg/mL)

3 討論

LPS是細胞因子的強誘導劑，可以誘導機體產生多種細胞因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α等炎性因子，使機體發(fā)生嚴重的炎癥反應[13]。本試驗通過宰前6 h腹腔注射LPS建立斷奶仔豬應激模型，探究大黃素對免疫應激仔豬器官指數(shù)、血清生化指標以及血清抗氧化能力的影響。

器官指數(shù)是判斷動物體器官發(fā)育狀況的一種重要的指標，其大小能夠在一定程度上反映該器官的發(fā)育情況和健康狀況[14]。多數(shù)中草藥成分本身并沒有毒性，但是進入機體后在代謝過程中可能會轉化為毒性化合物而導致機體損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能通過抑制線粒體呼吸鏈復合物的功能影響氧化磷酸化途徑，最終導致線粒體損傷和體外肝細胞凋亡[15]。大黃素對尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）具有一定的抑制作用，可導致膽汁代謝紊亂，引起膽汁淤積性肝損傷[16]。本試驗中，大黃素的添加會使仔豬肝臟和肺臟的器官指數(shù)呈降低趨勢，但無顯著差異，說明300 mg/kg大黃素可能會在一定程度上影響仔豬肝臟和肺臟的正常發(fā)育。

血清生化指標能夠反映機體的生理狀態(tài)和健康狀況。血清生化的各項指標中，TP 和ALB 含量的高低能直接反映機體蛋白質合成代謝狀況[17-18]。ALT和AST 被認為是肝功能的敏感標志物[19]，當肝臟受到損傷時，ALT和AST會被釋放到血液循環(huán)中。CRE是反映腎功能的重要指標，CRE 含量升高時，意味著腎功能的損傷[20]，ALP 活性的高低可反映動物對蛋白質和脂類的代謝效率[21]，同時其是膽汁淤積性肝病中最先升高的酶[22]。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬腹腔注射LPS會顯著提高血清AST和ALP活性。魏嘯等[24]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射LPS 會顯著升高血清中CRE 水平。本試驗中，LPS導致仔豬血清中ALP和CRE含量顯著提高，與上述報道一致，表明LPS 可能會誘導肝臟和腎臟功能損傷。有研究表明，大黃素能通過抑制Toll 樣受體4（TLR4）信號通路下游蛋白的表達減輕LPS 誘導的急性肝損傷[25]。王少杰等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能降低脂肪肝小鼠血清中三酰甘油（TG）、AST、ALT 水平，具有肝保護作用。本試驗中，日糧中添加大黃素能緩解LPS 導致的仔豬血清ALP 和CRE 含量異常升高，說明300 mg/kg 大黃素可能對LPS 誘導的肝臟和腎臟功能損傷有一定的保護作用。

正常情況下，機體內自由基的產生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當自由基的產生超出了機體的清除能力時，就會打破平衡而導致氧化應激[27]。血清中MDA、SOD、GSH、GSH-Px、CAT 和T-AOC 是反映機體氧化應激程度以及抗氧化能力的指標。GSH 是機體內最重要的非酶性抗氧化物，能夠清除自由基，GSH 的含量是衡量機體抗氧化能力的重要因素[28]。GSH-Px能夠以GSH 為底物，特異催化GSH 對過氧化氫的還原反應[29]。CAT能夠與SOD協(xié)作，降低過氧化氫對機體的損傷[30]。本試驗中，LPS顯著降低仔豬血清中CAT、GSH-Px 活性和GSH 含量，表示LPS 誘導機體產生了嚴重的氧化應激。潘廣濤等[31]發(fā)現(xiàn)，大黃素可以通過調節(jié)肝臟氧化應激對急性肝損傷起保護作用。張昊悅等[32]試驗發(fā)現(xiàn)，大黃素能調節(jié)Nrf-2/HO-1和MAPK信號通路，抑制LPS誘導的細胞炎癥和氧化應激。本試驗中，日糧中添加大黃素能緩解LPS導致的仔豬血清抗氧化酶活性降低，同時提升T-AOC，與以上報道一致，說明300 mg/kg 大黃素可以提高仔豬抗氧化能力，緩解斷奶仔豬的氧化應激。

IL-1β、IL-6、白細胞介素12（IL-12）、白細胞介素17（IL-17）和TNF-α等促炎細胞因子水平顯著升高是機體炎癥的重要特征[33]。LPS 由TLR4 識別，能激活NF-κB和MAPK信號通路，導致機體內的炎癥介質如一氧化氮（NO）產生，最終導致機體發(fā)生炎癥?？当＞鄣萚34]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬腹腔注射LPS后血清IL-6和TNF-α水平升高。本試驗在LPS組仔豬血清中觀察到較高的IL-6和TNF-α水平，意味著仔豬體內有炎癥發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能調節(jié)Nrf-2/HO-1和MAPK信號通路，抑制LPS誘導的細胞炎癥[32]。此外，大黃素能通過PPARγ依賴途徑抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥[35]。本試驗中，日糧中添加300 mg/kg大黃素能緩解LPS導致的仔豬血清IL-6和TNF-α水平升高，說明大黃素具有抗炎作用，能緩解LPS誘導的仔豬炎癥。

4 結論

日糧中添加300 mg/kg大黃素可以提高仔豬機體抗氧化能力，緩解LPS誘導的斷奶仔豬氧化應激和炎癥。