簡析凝乳酶凝乳機(jī)理及羔羊凝乳酶自制方法

周希梅，趙 華，黃萌萌，李競(jìng)前，閆奎友

全國畜牧總站，北京 100125

0 引言

凝乳酶（Chymosin）對(duì)奶酪生產(chǎn)至關(guān)重要。早在公元3—4世紀(jì)，人類就偶然發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胃中某種成分可使乳凝固，這是人們認(rèn)識(shí)凝乳酶的伊始[1]。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，制作奶酪用的工業(yè)化商品凝乳酶已經(jīng)取得了許多突破，但在國內(nèi)家庭牧場(chǎng)和羊乳企業(yè)小規(guī)模生產(chǎn)制作奶酪上，凝乳酶的傳統(tǒng)提取方法仍是解決其來源的最為簡單易行的核心關(guān)鍵技術(shù)。

1 凝乳酶種類及作用機(jī)理

1.1 種類

根據(jù)凝乳酶來源的不同，可以分為動(dòng)物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶、遺傳工程凝乳酶四大類。

1.1.1 動(dòng)物凝乳酶

在傳統(tǒng)意義上，動(dòng)物凝乳酶一般是指從多胃反芻動(dòng)物（犢牛、羔羊等）的第四胃（皺胃）提取出來的，可使乳凝固的酶制品——皺胃酶（Rennet），有時(shí)也稱“天然動(dòng)物酶”。皺胃酶的主要成分是凝乳酶、胃蛋白酶（Pepsin）等，均歸類于天冬氨酸肽酶，除此之外，還含少量多肽、核苷、含氮堿基、氨基酸、甘油和脂肪酸等。

小牛皺胃中的凝乳酶占比高達(dá)90%。經(jīng)提取后，皺胃酶中的凝乳酶占比為50%～80%。凝乳酶能特異性水解κ-酪蛋白產(chǎn)生酪蛋白巨肽，近而形成凝乳，而胃蛋白酶的水解特異性并不專一，可同時(shí)水解含苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、蘇氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）的肽鍵。

豬胃蛋白酶比小牛胃蛋白酶更接近小牛皺胃酶，但因其穩(wěn)定性差，易受熱鈍化失活，單獨(dú)使用活性低，對(duì)奶酪成熟中的蛋白質(zhì)降解貢獻(xiàn)極小，使奶酪成熟變得非常慢，組織狀態(tài)也差。當(dāng)豬胃蛋白酶與粗制的皺胃酶混合使用時(shí)，總體效果可接受，能替代一部分皺胃酶。

駱駝?dòng)? 個(gè)胃（無瓣胃），駝胃的凝乳酶具有特殊的κ-酪蛋白水解活力，優(yōu)于小牛皺胃酶。用駝胃的凝乳酶制作奶酪時(shí)，非特異性降解蛋白損失少，奶酪產(chǎn)出率高，且苦味少，制成復(fù)合凝乳酶制劑，可達(dá)到或超過小牛皺胃酶的凝乳效果。水牛胃的凝乳酶穩(wěn)定性和活性與小牛皺胃酶截然不同，其凝乳具有獨(dú)特的專一性，僅適合水牛乳奶酪的生產(chǎn)。

1.1.2 植物凝乳酶

自然界的許多植物都含蛋白酶。從其中提取汁液，進(jìn)行凝乳酶研究的包括木瓜、蓖麻籽油、無花果、菠蘿等的蛋白酶。截至目前，已經(jīng)從各類樹木中提取出40 多種能夠凝乳的酶，但它們水解速度過快，會(huì)過度水解蛋白質(zhì)而產(chǎn)生苦味肽，影響風(fēng)味和凝乳，因此，僅適于成熟需要幾天的軟質(zhì)奶酪，而不適于需要長時(shí)間成熟的硬質(zhì)奶酪。

從木瓜提取的木瓜蛋白酶可使牛乳和羊乳凝固，其特點(diǎn)為蛋白質(zhì)分解力強(qiáng)，脂肪損失小，奶酪成品得率高，但制成的奶酪?guī)в忻黠@的苦味，很難推廣，只能用于生產(chǎn)某些新鮮奶酪、稀奶油奶酪以及只需要短期發(fā)酵的軟質(zhì)奶酪，如細(xì)菌發(fā)酵成熟的手工奶酪和霉菌發(fā)酵成熟的卡門貝爾奶酪等。

新鮮無花果汁經(jīng)結(jié)晶分離，能成功提取無花果蛋白酶，可用其制作半硬質(zhì)奶酪，凝乳與成熟的效果都較好，但對(duì)蛋白質(zhì)分解力較強(qiáng)，脂肪損失多，奶酪成品得率低，且有苦味。

目前只有白花牛角瓜（Calotropis procera L）、碎米芥（Cardamine hirsuta L.）、捕蟲堇（Pinguicula alpina L.）、蓬子菜（Galium verum L.）及薊屬（Cynara L.）等植物酶被認(rèn)為比較適合制作各種奶酪。其中薊屬植物中的刺菜薊和菜薊非常適合生產(chǎn)以綿羊乳和山羊乳為原料的奶酪，國外應(yīng)用比較多。

1.1.3 微生物凝乳酶

來源于傳統(tǒng)意義上的凝乳酶數(shù)量有限，不能滿足奶酪生產(chǎn)需求。20世紀(jì)60年代，微生物凝乳酶開始應(yīng)用，最為成功的是米黑毛霉（Mucor miehei）和微小毛霉（Mucor pusillus）凝乳酶，但用其生產(chǎn)的奶酪成品得率較低，成熟后風(fēng)味不夠理想，容易因發(fā)酵過度而造成奶酪質(zhì)地不佳。

1.1.4 基因工程凝乳酶

隨著基因工程技術(shù)不斷發(fā)展，使凝乳酶基因在微生物宿主進(jìn)行表達(dá)成為現(xiàn)實(shí)。目前全球大多數(shù)凝乳酶都是借助微生物生產(chǎn)的，大致分成霉菌、細(xì)菌、擔(dān)子菌三種來源。其中應(yīng)用最多的是源于霉菌的凝乳酶。微生物凝乳酶制作周期短、產(chǎn)量高，不受自然地域的限制，制造成本低，酶純度高。

基因工程凝乳酶已成功應(yīng)用于凝乳酶的批量生產(chǎn)，大大緩解了傳統(tǒng)動(dòng)物凝乳酶的供應(yīng)不足?；蚬こ棠槊概c天然動(dòng)物皺胃酶幾乎一致，對(duì)酪蛋白水解活力非常相似，且已獲得安全性認(rèn)定，在許多國家得到廣泛應(yīng)用。

近些年，人們通過克隆山羊凝乳酶原cDNA，使其在酵母中進(jìn)行表達(dá)，所生成的cDNA編碼序列與山羊凝乳酶原的基因編碼具有高度相似性。正是由于克隆山羊凝乳酶所表現(xiàn)出的對(duì)κ-酪蛋白的高度特異性，因此，使其廣泛運(yùn)用于山羊奶酪的制作。人工克隆綿羊凝乳酶原的cDNA在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)凝乳效果和成品品質(zhì)均與羔羊皺胃酶非常類似。

1.2 凝乳酶作用機(jī)理

在奶酪生產(chǎn)中，凝乳的方法歸納起來主要有4 種。一是酶法凝乳。凝乳酶可以使κ-酪蛋白不穩(wěn)定，在鈣離子參與下發(fā)生聚合；二是酸法凝乳，酸化而引發(fā)的凝乳，凝乳的溫度通常為60~80 ℃；三是熱誘導(dǎo)凝乳，主要發(fā)生在乳被高溫加熱的情況；四是加鹽與加熱共同作用的凝乳，如我國廣東等南方地區(qū)的乳餅（Milk Cake）[2]、意大利里科塔（Ricotta）奶酪等。在這四種凝乳方法中，第一種酶法凝乳是全世界奶酪制作應(yīng)用最為廣泛的，也是本部分論述的重點(diǎn)。

1.2.1 凝乳酶的凝乳過程

乳中酪蛋白不穩(wěn)定，可以在一定條件下凝聚而凝固，是制作奶酪的基本前提，凝乳則是奶酪生產(chǎn)中至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

乳中酪蛋白約90%以微團(tuán)狀態(tài)存在，稱為酪蛋白膠束，均勻分散在乳中，構(gòu)成酪蛋白膠體系。酪蛋白膠束中的κ-酪蛋白是以低聚物形式存在的，約6 個(gè)分子組成，分布于膠束表面。κ-酪蛋白分子的親水C-末端從膠束內(nèi)部以柔韌“發(fā)層”伸向液相，具有極強(qiáng)的自由度，“發(fā)層”厚度約7 nm。C-末端始于殘基86、96位處，凝乳酶分解苯丙氨酸、甲硫氨酸（Phe-Met）鍵位于殘基的105、106位。酪蛋白膠束表面“發(fā)層”架構(gòu)形成位阻空間，使膠束穩(wěn)定在乳中。

酶凝固，首先始于酪蛋白酶水解，凝乳酶對(duì)κ-酪蛋白的作用點(diǎn)位于κ-酪蛋白的N-末端105位的苯丙氨酸與106位的蛋氨酸的肽鍵結(jié)合處，因酶作用而裂成2 個(gè)片段，N-末端側(cè)的，稱副κ-酪蛋白，而C-末端側(cè)的，稱酪蛋白巨肽。前者疏水性高、不溶于水，后者親水性高并含糖[2]。

κ-酪蛋白水解度達(dá)到一定程度時(shí)，水解位點(diǎn)又相互結(jié)合，發(fā)生副酪蛋白的聚合，隨著線形鏈的生成，增強(qiáng)了乳黏度，進(jìn)而加劇相互交聯(lián)而成網(wǎng)構(gòu)狀，液體介質(zhì)充滿網(wǎng)構(gòu)間隙中，誘發(fā)液膠-凝膠的轉(zhuǎn)變（Sol-Gel Translation），乳由黏性流體，變成黏彈性的固體。隨著酪蛋白結(jié)構(gòu)重排，借助乳中的游離鈣離子，促成了更多交聯(lián)鍵，稱“鈣橋”，隨著凝塊漸厚，最終發(fā)生膠凝化凝固，膠體脫水收縮，至乳清析出。

1.2.2 羊乳的酶凝固

羊乳，其凝乳酶的凝乳過程與前文所述基本一致。通常，羔羊凝乳酶凝固羊乳的效率較高，但羊乳的pH、溫度會(huì)直接影響酶凝乳的效果，為了進(jìn)一步提高凝乳效率，在加入羔羊凝乳酶之前，還需增加兩個(gè)重要輔助手段，即加入乳酸菌發(fā)酵劑控制乳的酸度和通過加熱保溫設(shè)備控制凝乳的溫度。

副酪蛋白聚合階段對(duì)乳的溫度很敏感，主要蛋白質(zhì)的分解階段發(fā)生在pH5.20～5.80范圍。在凝乳酶、發(fā)酵劑的共同作用下，乳蛋白質(zhì)被降解成肽類，對(duì)促進(jìn)奶酪后期成熟極其關(guān)鍵，肽類被微生物進(jìn)一步利用或降解，便產(chǎn)生奶酪的特殊風(fēng)味和滋味。

當(dāng)乳pH為4.6，即酪蛋白等電點(diǎn)，在溫度為20 ℃時(shí)，所得到的蛋白質(zhì)即為酪蛋白，構(gòu)成奶酪的主要蛋白質(zhì)。與其他哺乳動(dòng)物一樣，羊乳的酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白組成。酪蛋白屬兩性電解質(zhì)，在乳中以酪蛋白酸鈣與磷酸鈣的復(fù)合形態(tài)存在，對(duì)pH高低非常敏感，尤其等電點(diǎn)高于其他蛋白的β-酪蛋白。當(dāng)pH降至等電點(diǎn)以下，鈣離子和β-酪蛋白從膠束中被釋放，因β-酪蛋白帶正電荷，其他蛋白帶負(fù)電荷，便引發(fā)蛋白質(zhì)相互吸引，最終形成蛋白質(zhì)凝固與沉淀。

2 羔羊凝乳酶自制方法

哺乳期小羔羊胃主要分泌的消化酶是皺胃酶。當(dāng)飼喂母羊乳汁以外的飼料時(shí)，其胃就開始分泌胃蛋白酶，隨著月齡增大，胃蛋白酶比例逐步增加，而皺胃酶逐漸減少。因此，自制提取羔羊皺胃酶時(shí)，應(yīng)選用正處于哺乳期的小山羊或小綿羊的第四胃（皺胃），所得羔羊皺胃酶含量和活力能夠達(dá)到最佳。

2.1 羔羊皺胃的處理

挑選健康的0～4 周齡羔羊，宰前10 h停止飼喂。宰后立即切取皺胃。由于皺胃的上半部分所分泌的酶數(shù)量最多，應(yīng)從第三胃（瓣胃）的末端處切取，而下部分也應(yīng)從第四胃（皺胃）十二直腸的上部分切斷（圖1），確保不損失有效皺胃酶成分。

圖1 皺胃切取示意圖[3]

以潔凈的流水，沖洗皺胃，去除胃內(nèi)殘留物，并剔凈脂肪與結(jié)締組織，放置在-18 ℃條件下進(jìn)行冷凍備用。當(dāng)提取凝乳酶時(shí)，要記錄本批次所用皺胃的個(gè)數(shù)，并對(duì)皺胃統(tǒng)一進(jìn)行混合及充分粉碎，確保處理混勻，完全制成肉糜狀。

2.2 操作步驟

用食鹽酒精混合液浸泡肉糜。其中，食鹽濃度4%～5%，酒精濃度10%～12%。具體操作步驟如下。

2.2.1 浸泡保存

按每個(gè)羔羊皺胃需用食鹽酒精液200 mL的用量，對(duì)肉糜進(jìn)行充分浸泡，并置于陰暗且避光處保存5 d。注意每天應(yīng)進(jìn)行2 次以上的充分?jǐn)嚢琛?/p>

2.2.2 離心處理

至第6 d時(shí)，小心收集上清液，將下部分的渾濁體與殘?jiān)?，用離心機(jī)實(shí)施進(jìn)一步分離，所得的液體，再與上清液混合一處，得到浸出液。注意保留分離的殘?jiān)?/p>

2.2.3 浸泡殘?jiān)?/p>

按每個(gè)皺胃用2.2.2得到的浸出液100 mL的比例用量，回加入已分離的殘?jiān)?，攪拌并置陰暗避光處，再浸? d時(shí)間后，以2.2.2同樣的方式，再提取而成浸出液。

2.2.4 澄清處理

將步驟2.2.2和2.2.3的浸出液，全部混合一處，置于潔凈的玻璃容器內(nèi)，按5%的比例，慢慢加入濃度1 mol/L的鹽酸并攪拌，靜止5～10 min，原來渾濁的浸出液開始出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，浸出液主體逐漸變得較為清澈，少量黏性物質(zhì)形成沉淀物，沉于容器底部。

2.2.5 鹽度與pH值

分離剔除沉淀物后，按一定比例向浸出液中再加入食鹽，使浸出液的含鹽控制在約15%。再將浸出液的pH調(diào)整至5～6，即為液體羔羊凝乳酶。置2～6 ℃陰暗避光處保存。測(cè)定活力后，隨時(shí)可以用于羊奶酪的生產(chǎn)。

上述全程操作可在常溫下進(jìn)行。有條件時(shí)，也可采用升華干燥法將液體凝乳酶制成粉末狀，以方便貯存和運(yùn)輸。

2.3 注意事項(xiàng)

因?yàn)楦嵫騻€(gè)體差異以及月齡不同，每個(gè)批次的羔羊皺胃浸提液中的凝乳酶與胃蛋白酶可能含量有所不同，為此，可將不同批次制得的浸提液，混合在一起，并用蒸餾水統(tǒng)一稀釋到一定的濃度，備用于生產(chǎn)。這樣做的目的，是為預(yù)防因不同批次制得的浸提液酶濃度不一（過高或過低）而引發(fā)羊乳的凝固不均勻，導(dǎo)致不同批次羊奶酪的品質(zhì)（質(zhì)地結(jié)構(gòu)）出現(xiàn)差異，影響產(chǎn)品質(zhì)量。

混合浸提液的稀釋倍數(shù)，可根據(jù)浸提液存放時(shí)間和所測(cè)得的活力而定。通常情況下，1 個(gè)羔羊皺胃所自制成的凝乳酶，能凝固羊乳1 200~1 500 L。

3 羔羊凝乳酶活力測(cè)定

掌控凝乳酶活力的強(qiáng)弱，是羊奶酪生產(chǎn)中非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。供應(yīng)商提供的商品凝乳酶，可按供應(yīng)商提供的應(yīng)用技術(shù)說明方法使用，一般按批次包裝進(jìn)行一次凝乳酶活力測(cè)試，做好記錄標(biāo)識(shí)。

同樣，針對(duì)自制的羔羊凝乳酶，須按凝乳酶制作批次進(jìn)行活力測(cè)定。按照每批次生產(chǎn)羊奶酪所用羊乳的重量，生產(chǎn)操作人員應(yīng)準(zhǔn)確計(jì)算和量取凝乳酶的用量。在實(shí)際生產(chǎn)中，通常用凝乳槽（罐）一次所能容納的羊乳重量，作為計(jì)算依據(jù)。出于操作簡單和生產(chǎn)效率，注意應(yīng)做到每次凝乳槽（罐）均保證是恒定的羊乳重量。

3.1 凝乳酶活力

凝乳酶活力，一般是指100 mL的1%凝乳酶溶液（或1 g凝乳酶干粉），在固定溫度下（35 ℃）和固定時(shí)間內(nèi)（40 min），能夠凝固羊乳的毫升數(shù)（mL）。

為方便生產(chǎn)一線操作人員進(jìn)行凝乳酶活力測(cè)定，準(zhǔn)確管控凝乳酶用量，下面介紹一種簡單實(shí)用的凝乳酶具體用量的計(jì)算方法。

3.2 測(cè)定活力步驟

設(shè)施與試劑主要有粗天平、溫度計(jì)、100 mL量筒、漏斗、普通濾紙、玻璃棒、150～200 mL燒杯、150 mL三角燒瓶、蒸餾水等。為方便表述，現(xiàn)以羔羊皺胃酶干粉為例。測(cè)定方法如下。

3.2.1 配制1%凝乳酶溶液

稱取1 g的凝乳酶干粉，置放于150 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL35 ℃的蒸餾水。充分混溶后，確保靜止15 min后過濾，保留濾液。提示：配制好的酶溶液，應(yīng)在2 h之內(nèi)完成活力測(cè)定。

3.2.2 記錄開始凝乳時(shí)間

用量筒量取100 mL羊乳（供試乳，需取自用來制作羊奶酪的同一批次原料乳）置放于150～200 mL的燒杯內(nèi)，通過水浴加熱到35 ℃后，再加1 mL已配制好的1%酶溶液，并立即以玻璃棒用同方向進(jìn)行攪拌，同時(shí)，記下開始時(shí)間（min）。

3.2.3 記錄羊乳凝固時(shí)間

以玻璃棒，用同方向進(jìn)行攪拌羊乳后，取出玻璃棒，立即在羊乳的表面上置一個(gè)小片紙屑（或木炭顆粒），以此來觀察羊乳凝固狀態(tài)。當(dāng)紙屑（或木炭顆粒）停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，即表明羊乳已凝固，記下此刻的時(shí)間（min）。前后的時(shí)間差即為凝乳時(shí)間（min）。

3.3 凝乳酶活力計(jì)算

3.3.1 計(jì)算演示

如100 mL的1%羔羊凝乳酶溶液，在9 min內(nèi)，使100 mL的羊乳發(fā)生凝固，則該羔羊凝乳酶的活力為：

3.3.2 結(jié)果應(yīng)用

100 mL1%的羔羊凝乳酶溶液（或1 g凝乳酶粉），能使44 000 mL的羊乳凝固。生產(chǎn)制造羊奶酪時(shí)，就可按此比例，再計(jì)算出應(yīng)加入到羊乳中的凝乳酶用量。

4 小結(jié)

本文通過簡析凝乳酶凝乳原理并結(jié)合羊乳的凝乳條件和特點(diǎn)，重點(diǎn)介紹了自行提取制備羔羊凝乳酶的技術(shù)方法。其中，羔羊皺胃選取與處理、充分浸泡和離心處理，以及浸出液鹽度與pH值調(diào)整至關(guān)重要，直接影響羊乳凝乳效果和羊奶酪成品產(chǎn)出率，須嚴(yán)格管控操作步驟和重要技術(shù)參數(shù)。