基于組合優(yōu)化策略在畢赤酵母中高效表達(dá)杜邦嗜熱菌脂肪酶

汪步青，陳 洲，王亞森，許向陽，高曉冬，藤田盛久，李子杰

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.棗莊市杰諾生物酶有限公司，山東 棗莊 277100)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物中的蛋白類?；视退饷?，在自然條件下能夠在油水混合界面催化油脂生成不同鏈長的游離脂肪酸、酯類和甘油等物質(zhì)，而在非水相體系中參與催化酯交換、酯化、酸解和氨解等多種類型反應(yīng)[1-2]。脂肪酶具有催化效率高、反應(yīng)過程溫和、對底物的特異性催化活力等特性，被廣泛應(yīng)用于食品、洗滌劑、造紙、生物能源和生物醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域[3-5]。

杜邦嗜熱菌(Thermomycesdupontii)脂肪酶，即Talaromycesthermophilus脂肪酶(LIP1)，是一種堿性脂肪酶，因其極高的熱穩(wěn)定性而廣受關(guān)注，LIP1的最適催化溫度為60℃，并且經(jīng)70℃水浴處理1 h依舊保持50%以上的催化活性[6]。研究表明，LIP1在許多工業(yè)生產(chǎn)中具有應(yīng)用潛力[6-8]。Romdhane等[6]研究發(fā)現(xiàn)，LIP1在堿性pH和不同的表面活性劑中具有良好的穩(wěn)定性，有助于其作為添加劑在洗滌劑中的應(yīng)用。同時，LIP1具有優(yōu)異的催化酯交換活性，有助于其在生物柴油生產(chǎn)中的應(yīng)用[7]。此外，隨著對LIP1研究的開展，其顯示出具有制備手性藥物中間體的潛力[8]。然而杜邦嗜熱菌培養(yǎng)過程復(fù)雜，LIP1發(fā)酵酶活低，生產(chǎn)成本過高，無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此，實現(xiàn)LIP1高效表達(dá)尤為重要。

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)異源表達(dá)系統(tǒng)由于其高效表達(dá)水平、強大的分泌能力、完善的誘導(dǎo)表達(dá)方法以及成熟的高密度發(fā)酵能力被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，LIP1在畢赤酵母中的搖瓶分泌酶活為156 U/mL，是其在杜邦嗜熱菌中的2.6倍[9]。因而，采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種有效提高LIP1表達(dá)的方法。此外，據(jù)以往的研究可知，優(yōu)化提升畢赤酵母高效表達(dá)效率的手段有很多，但大多數(shù)文獻(xiàn)報道的都是單因素或雙因素優(yōu)化，總體的分泌表達(dá)水平提升不明顯；而采用組合優(yōu)化策略包括密碼子偏好性優(yōu)化、外源基因拷貝數(shù)的積累、更換分泌作用更強的信號肽、分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化用于過表達(dá)輔助蛋白從而促進(jìn)目的蛋白修飾和分泌、強啟動子優(yōu)化以及高密度發(fā)酵進(jìn)一步提高重組表達(dá)效率[11-14]，可獲得高水平分泌表達(dá)LIP1的重組菌株。

綜上，本研究采用組合優(yōu)化策略提高LIP1在畢赤酵母中的表達(dá)水平。首先，將LIP1密碼子偏好性優(yōu)化基因，連接至含醇氧化酶(AOX1)強啟動子的質(zhì)粒載體pPIC9K中，電擊轉(zhuǎn)化后成功構(gòu)建篩選出含多拷貝LIP1基因的異源表達(dá)重組酵母菌株；在此基礎(chǔ)上，研究了不同信號肽優(yōu)化以及分子伴侶共表達(dá)對LIP1分泌表達(dá)的影響；最后，將優(yōu)化篩選出的重組菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，實現(xiàn)LIP1在重組酵母中高效表達(dá)和積累。總之，在本研究中，借助畢赤酵母表達(dá)體系，利用基因工程技術(shù)提高LIP1的表達(dá)量，對促進(jìn)其實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、畢赤酵母GS115，江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室；表達(dá)載體pPIC9K和pPICZA，美國Invitrogen公司；DNA聚合酶、連接酶、限制性內(nèi)切酶等工具酶，美國Thermo Scientific公司；其他常規(guī)試劑，國藥集團(tuán); 不同鏈長的對硝基苯酚酯(C4、C8、C10、C12、C14和C16)，北京索萊寶科技有限公司；引物，無錫天霖生物有限公司。

LB、MD、YPD、BMGY、BMMY和BMMY-羅丹明B等培養(yǎng)基參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊配制。

壓力蒸汽滅菌鍋(立式)；無菌操作臺；臺式水平恒溫?fù)u床；5 L發(fā)酵罐；甲醇檢測流加監(jiān)控器；SDS-PAGE 凝膠電泳儀、核酸凝膠電泳儀和Western Blot快速轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構(gòu)建和畢赤酵母轉(zhuǎn)化

基因合成：LIP1基因(JF414585.1)由前體肽識別序列和成熟肽編碼序列構(gòu)成，含HA標(biāo)簽，經(jīng)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化后[15]，由無錫天霖生物有限公司合成至質(zhì)粒載體PUC57中。

重組質(zhì)粒載體構(gòu)建：將pPIC9K和PUC57用EcoR I和NotI進(jìn)行雙酶切，采用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，并用T4DNA連接酶連接，熱激轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中后成功構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-LIP1。

畢赤酵母轉(zhuǎn)化：將表達(dá)載體pPIC9K-LIP1經(jīng)SalI線性化、回收和濃縮后，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，涂板于MD平板上。2～3 d后將MD平板中的轉(zhuǎn)化子，依次挑至含不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/mL)G418(遺傳霉素)的YPD平板，30℃培養(yǎng)2～3 d后，篩選出含多拷貝基因的重組菌株。并將獲得的重組菌株接種于BMMY-羅丹明B定性篩選平板中，30℃培養(yǎng)3～4 d后篩選出透明圈大(脂肪酶水解油脂產(chǎn)生透明圈)的菌株用于進(jìn)一步的LIP1的表達(dá)和檢測。

1.2.2 脂肪酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)策略

信號肽優(yōu)化：根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化設(shè)計信號肽D1 signal sequence (D1ss)、D2 signal sequence(D2ss)、FLD1 signal sequence(Fss)、MFH4 signal sequence(Mss)、W1 signal sequence(Wss)、Glucoamylase signal sequence(Gss)的基因序列，并根據(jù)上述信號肽的基因序列為模板設(shè)計引物擴(kuò)增出信號肽，并經(jīng)過BamH I和EcoR I 雙酶切后用T4DNA連接酶連接至pPIC9K-LIP1，替換質(zhì)粒pPIC9K中的α-factor信號肽，構(gòu)建出質(zhì)粒pPIC9K-D1ss-LIP1、pPIC9K-D2ss-LIP1、pPIC9K-Fss-LIP1、pPIC9K-Mss-LIP1、pPIC9K-Wss-LIP1和pPIC9K-Gss-LIP1。并參考1.2.1的方法進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化，篩選出酶活高的重組菌株，作為出發(fā)菌株。

分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化：首先，在NCBI網(wǎng)站中獲得分子伴侶BMH2 (XM_002490942.1)、HAC(XP_002490039.1)、KEX2(XM_002491154.1)、SSA4(XM_002493814.1)、PDI(CAC33588.1)和UBC1(XM_002492398.1)的基因序列，并依據(jù)基因序列設(shè)計引物，以提取的畢赤酵母GS115基因組為模板，擴(kuò)增出相應(yīng)的分子伴侶片段。并經(jīng)過BamH I和EcoR I 酶切后用T4DNA連接酶連接至pPICZA中，構(gòu)建出質(zhì)粒pPICZA-BMH2、pPICZA-HAC、pPICZA-KEX2、pPICZA-SSA4、pPICZA-PDI、pPICZA-UBC1。采用SalI線性化pPICZA-BMH2、pPICZA-KEX2、pPICZA-SSA4和pPICZA-UBC1，SacI線性化pPICZA-HAC和pPICZA-PDI，回收和濃縮后，電擊轉(zhuǎn)化至出發(fā)菌株中，并參考1.2.1的方法進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化，篩選出酶活高的重組菌株。

1.2.3 畢赤酵母搖瓶發(fā)酵

將篩選出的重組菌株接種于5 mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h,將菌液按4%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)至OD600為20左右，離心收集菌體，使用50 mL無菌水(預(yù)冷)洗兩遍并離心收集，重懸于50 mL的BMMY培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵培養(yǎng)，每24 h加入1%的甲醇誘導(dǎo)，同時取上清液，采用SDS-PAGE和Western Blot檢測LIP1的蛋白表達(dá)，并測定酶活。

1.2.4 5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

將采用組合優(yōu)化策略篩選出的重組菌株接種于10 mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，取菌液按4%接種量轉(zhuǎn)接至200 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，作為發(fā)酵種子液。將發(fā)酵種子液接種于含2 L BSM無機鹽培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，采用50%磷酸和氨水自動流加調(diào)節(jié)pH，保持pH為5.5，溫度為30℃。待BSM無機鹽培養(yǎng)基中甘油消耗完全，溶氧反彈后，保持發(fā)酵pH和溫度不變進(jìn)入流加甘油培養(yǎng)階段，采用DO-Star方式流加甘油，待濕重達(dá)到220 g/L以上時，停止甘油流加并饑餓處理30 min后，進(jìn)入流加甲醇誘導(dǎo)階段。此時，調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度至27℃，將甲醇緩慢流加至培養(yǎng)液中，通過甲醇檢測器檢測發(fā)酵液中的甲醇含量，每隔24 h取樣檢測OD600、細(xì)胞干質(zhì)量、脂肪酶的蛋白表達(dá)水平及上清LIP1酶活，甲醇誘導(dǎo)7 d后，停止流加甲醇，發(fā)酵結(jié)束。

1.2.5 重組脂肪酶的活性檢測

LIP1活性檢測采用堿滴定法[16]。在50 mL三角瓶中，依次加入5 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 10.0)和4 mL高速勻漿機處理的橄欖油與聚乙烯醇乳化液(橄欖油與聚乙烯醇比例1∶3)，在60℃水浴中預(yù)熱5 min。加入1 mL 60℃預(yù)熱稀釋的發(fā)酵上清液(空白組加入60℃預(yù)熱的1 mL Tris-HCl)，在60℃水浴中反應(yīng)10 min后，立即加入15 mL 95%乙醇溶液終止反應(yīng)。向三角瓶中滴入2滴酚酞指示劑，采用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，直至液體呈微紅色并保持30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。單位LIP1酶活力以每分鐘產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸的所需酶量表示。

1.2.6 重組脂肪酶的底物特異性檢測

重組脂肪酶LIP1的底物特異性采用比色法[17]測定。在1.5 mL EP管中加入80 μL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.5)，依次加入10 μL稀釋至200 U/mL的1.2.3發(fā)酵上清液和10 μL不同鏈長的對硝基苯酚酯(C4、C8、C10、C12、C14和C16)，35℃反應(yīng)5 min，最后加入100 μL 1%的SDS溶液終止反應(yīng)，在405 nm下測定吸光值，以測定酶活最高時底物下的酶活為100%，計算其他底物下的相對酶活。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗進(jìn)行3次平行，結(jié)果以平均值表示。采用Origin 8.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，同時進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建和畢赤酵母轉(zhuǎn)化

按1.2.1方法進(jìn)行載體的構(gòu)建和畢赤酵母轉(zhuǎn)化,菌落PCR驗證和BMMY-羅丹明B平板篩選結(jié)果見圖1。

注：M.DNA Marker；1.特異性引物PCR驗證產(chǎn)物(圖A)；1.畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子菌落PCR(圖B)；CK.GS115/pPIC9K(圖C)；1～13.GS115/pPIC9K-LIP1(圖C)

由圖1A可看出，LIP1(含HA標(biāo)簽)全長為870 bp，與重組質(zhì)粒經(jīng)LIP1上下游特異性引物PCR獲得的條帶大小一致，說明重組質(zhì)粒載體pPIC9K-LIP1構(gòu)建成功。由圖1B可看出，經(jīng)G418的YPD平板梯度篩選出的含多拷貝基因重組菌株，采用pPIC9K通用引物進(jìn)行菌落PCR驗證發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與預(yù)期相符。由圖1C可看出，重組菌株經(jīng)BMMY-羅丹明B平板培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)大小不一的透明圈，篩選存在最大透明圈的菌株用于LIP1的表達(dá)。

2.2 脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)

將1.2.1經(jīng)BMMY-羅丹明B平板篩選的透明圈最大的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-LIP1按1.2.3方法發(fā)酵，發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并以HA為標(biāo)簽，進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2A可看出，重組菌株在約32 kDa處出現(xiàn)條帶，與目的蛋白大小相符，通過堿滴定法測定LIP1的酶活達(dá)到576 U/mL。由圖2B可看出，在32 kDa位置確實存在條帶。因此，結(jié)合SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果表明LIP1在畢赤酵母中成功表達(dá)。

注：M. Marker； 1.發(fā)酵上清液中的LIP1

2.3 信號肽對脂肪酶在畢赤酵母中表達(dá)水平的影響

為提高LIP1在畢赤酵母中的分泌效率，本研究優(yōu)化了LIP1的分泌型信號肽，如表1所示。

表1 本研究所用的信號肽

由表1可知，選取6種畢赤酵母同源的分泌型信號肽，成功構(gòu)建出6株不同信號肽替換優(yōu)化的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-D1ss-LIP1、GS115/pPIC9K-D2ss-LIP1、GS115/pPIC9K-Fss-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-LIP1、GS115/pPIC9K-Wss-LIP1和GS115/pPIC9K-Gss-LIP1。采用BMMY-羅丹明B平板進(jìn)行篩選，挑選透明圈最大的轉(zhuǎn)化子按1.2.3方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵上清液中LIP1的蛋白表達(dá)水平和酶活測定結(jié)果如圖3所示。

注：M. Marker；CK. GS115/pPIC9K-LIP1；1.GS115/pPIC9K-D1ss-LIP1；2.GS115/pPIC9K-D2ss-LIP1；3.GS115/pPIC9K-Fss-LIP1；4.GS115/pPIC9K-Mss-LIP1；5.GS115/pPIC9K-Wss-LIP1；6.GS115/pPIC9K-Gss-LIP1

由圖3可看出，信號肽D1ss、D2ss、Fss、Mss優(yōu)化菌株均在32 kDa處有條帶，且信號肽D1ss、D2ss及Mss均可促進(jìn)LIP1的分泌表達(dá)，對應(yīng)的發(fā)酵上清液中LIP1酶活分別達(dá)到674、640、835 U/mL，是出發(fā)菌株GS115/pPIC9K-LIP1(CK)酶活的1.17、1.11 倍及1.45倍，其中信號肽Mss的分泌效果最強。因此，篩選菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗。

2.4 分子伴侶對脂肪酶在畢赤酵母中表達(dá)水平的影響

以GS115/pPIC9K-Mss-LIP1作為出發(fā)菌株，按1.2.2分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化方法成功構(gòu)建6株共表達(dá)不同分子伴侶的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-BMH2-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-HAC-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-KEX2-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-PDI-LIP1和GS115/pPIC9K-Mss-UBC1-LIP1，并采用BMMY-羅丹明B平板進(jìn)行篩選，挑選透明圈最大的轉(zhuǎn)化子按1.2.3方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。以GS115/pPIC9K-Mss-LIP1菌株作為對照，測定發(fā)酵上清液中LIP1的蛋白表達(dá)水平及酶活，結(jié)果如圖4所示。

注：M. Marker；CK. GS115/pPIC9K-Mss-LIP1；1.GS115/pPIC9K-Mss-BMH2-LIP1；2.GS115/pPIC9K-Mss-HAC-LIP1；3.GS115/pPIC9K-Mss-KEX2-LIP1；4.GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1；5.GS115/pPIC9K-Mss-PDI-LIP1；6.GS115/pPIC9K-Mss-UBC1-LIP1

由圖4可看出：6種分子伴侶共表達(dá)菌株均在32 kDa處有條帶，其中分子伴侶SSA4、BMH2、HAC以及PDI均可促進(jìn)LIP1的分泌表達(dá)，對應(yīng)發(fā)酵上清液中LIP1酶活分別達(dá)到1 136、970、885 U/mL和1 030 U/mL，分別為出發(fā)菌株的1.36、1.16、1.05 倍和1.23 倍，分子伴侶SSA4效果最好；而KEX2和UBC1的共表達(dá)抑制了LIP1的分泌，降低了LIP1的酶活。總之，基于組合優(yōu)化策略，依次經(jīng)過密碼子偏好性優(yōu)化、目的基因多拷貝、信號肽優(yōu)化以及分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化，最終篩選出一株脂肪酶活性最高的菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1，其酶活達(dá)到1 136 U/mL，是已報道的未經(jīng)過組合策略優(yōu)化的LIP1表達(dá)于畢赤酵母中酶活[9]的7.28倍。說明本研究采用的組合優(yōu)化策略能顯著提高LIP1在畢赤酵母中的表達(dá)水平。

2.5 重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵

重組酵母在發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，是進(jìn)一步提高LIP1重組表達(dá)效率的有效方法。Xu等[18]利用3 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)皺褶念珠菌脂肪酶的酵母重組菌，在高密度發(fā)酵130 h后，脂肪酶活性達(dá)到13 490 U/mL，相對于搖瓶培養(yǎng)提高了7.67倍。按1.2.4方法利用5 L發(fā)酵罐對GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，每隔24 h取樣，測定重組菌株的OD600、細(xì)胞干質(zhì)量、脂肪酶的蛋白表達(dá)水平及酶活，結(jié)果如圖5所示。

注：M. Marker；24、48、72、96、120、144、168 h分別為甲醇誘導(dǎo)時間

由圖5可看出，隨著誘導(dǎo)時間延長，重組LIP1的酶活和蛋白表達(dá)水平逐漸增加，當(dāng)誘導(dǎo)時間達(dá)到144 h時，重組LIP1的酶活最高，達(dá)到12 150 U/mL，是搖瓶發(fā)酵酶活的10.7倍，說明高密度發(fā)酵實現(xiàn)了LIP1在重組酵母中高效表達(dá)和積累。隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組菌株的OD600和細(xì)胞干質(zhì)量也在不斷增加，在誘導(dǎo)時間為168 h時，細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到最大，為120.5 g/L?？傊?，基于組合優(yōu)化策略的實施，可在發(fā)酵上清液中獲得大量重組LIP1(見圖5A)，有利于重組LIP1進(jìn)一步在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中的分離和純化。

2.6 重組脂肪酶的底物特異性(見圖6)

圖6 重組LIP1的底物特異性

脂肪酶特殊的底物特異性很大程度上決定了其在工業(yè)化中應(yīng)用的領(lǐng)域[19]。由圖6可看出：重組LIP1對不同鏈長的對硝基苯酚酯的水解能力差異很大，其對中鏈脂肪酸底物(C8和C10)呈現(xiàn)較高活性，最適底物為C8鏈長的對硝基苯酚酯；而當(dāng)?shù)孜锾兼滈L度大于12或低于8時，重組LIP1的催化活力顯著降低，表明重組LIP1對中鏈底物具有特異性的親和力，能夠特異性地水解生成大量的中鏈脂肪酸。由于中鏈脂肪酸獨特的生理生化功能，常應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食用油及養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域[20]，因而重組LIP1在中鏈脂肪酸的工業(yè)化生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

通過對杜邦嗜熱菌來源的脂肪酶密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合G418高濃度抗性篩選和BMMY-羅丹明B平板篩選，獲得了一株脂肪酶活性較高的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-LIP1，其酶活為576 U/mL；然后，通過信號肽優(yōu)化和分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化，獲得一株高效表達(dá)脂肪酶的畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1，其酶活達(dá)到1 136 U/mL；采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，誘導(dǎo)144 h后，脂肪酶酶活最高，達(dá)到12 150 U/mL，是搖瓶發(fā)酵的10.7倍。通過測定重組脂肪酶的底物特異性發(fā)現(xiàn)，其對中鏈(C8)底物的對硝基苯酚酯存在特異性的催化活性。后續(xù)研究將基于對高密度發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高LIP1的重組表達(dá)水平，為重組LIP1規(guī)?；a(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。