天然抗氧化劑對鱷魚油體外抗氧化活性的影響

傅麗君 ，王海燕 ，鄭雅鴻 ，楊 磊 ，李華亮，丁玉梅

(1.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室,福建 莆田 351100； 2.生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高校重點實驗室,福建 莆田 351100； 3.莆田學(xué)院 新工科產(chǎn)業(yè)學(xué)院，福建 莆田 351100; 4.福建鼉龍實業(yè)有限責(zé)任公司,福建 廈門 361026)

鱷魚全身都是寶，是現(xiàn)存最原始的動物之一。鱷魚體內(nèi)粗脂肪含量為3.5%～7.0%，鱷魚油含有多達24種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量在60%以上[1]。鱷魚油脂肪酸組成與深海魚油相似，富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，具有較高的經(jīng)濟價值[2]。《本草綱目》記載，鱷魚油主治“摩風(fēng)及惡瘡”，已被證實具有防凍傷、抗菌消炎等功效[3]。自2005年國家林業(yè)局批準了尼羅鱷、灣鱷和暹羅鱷3種鱷魚列入54種可商業(yè)利用的野生動物以來[3]，鱷魚油已廣泛應(yīng)用于化妝品、燙傷膏及消炎等產(chǎn)品的開發(fā)。如何更好地開發(fā)和利用鱷魚資源是目前需要解決的問題。

油脂中不飽和脂肪酸穩(wěn)定性差，極易氧化生成醛、酮類等有害物質(zhì)，從而損傷機體并危害人類健康[4-5]，因此延緩鱷魚油的氧化對其深加工和高值化利用尤為重要。目前，延緩油脂氧化的常用方法為添加抗氧化劑[6]。抗氧化劑作為一種外源性抗氧化物，可阻斷或抑制油脂氧化過程的某一環(huán)節(jié)[7]，從而抑制油脂氧化。隨著人工合成抗氧化劑的副作用被證實，油脂中添加高效、低毒、價廉的天然抗氧化劑成為研究熱點。目前鮮見關(guān)于鱷魚油抗氧化活性研究的相關(guān)報道。

本研究以前期精制鱷魚油為原料，采用Schaal烘箱法，比較茶多酚(TP)、維生素E(VE)和植酸3種常用天然抗氧化劑對鱷魚油的抗氧化效果，并優(yōu)選出天然抗氧化劑，采用體外抗氧化試驗，測定添加優(yōu)選抗氧化劑的鱷魚油對DPPH自由基、羥自由基、超氧自由基清除能力，還原能力和Fe2+螯合能力等抗氧化活性指標(biāo)，旨在為天然抗氧化劑篩選及提升鱷魚油抗氧化能力提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

精制鱷魚油,酸值(KOH)為(0.234±0.005)mg/g，過氧化值為(4.663±0.020)mmol/kg,由福建鼉龍實業(yè)有限責(zé)任公司提供。1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，南京奧多福尼生物科技有限公司;水楊酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;鄰苯三酚,國藥集團化學(xué)有限公司;菲啰嗪,上海伊卡生物技術(shù)有限公司;植酸,浙江仁和生物科技有限公司;維生素E、維生素C(VC),上海源葉生物科技有限公司；茶多酚(TP)，無錫世紀生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AEG-220型電子天平，日本島津公司;KQ-250E型超聲波清洗器,中國昆山超聲儀器有限公司；HH-4型系列數(shù)顯水浴鍋，金壇市白塔新寶儀器廠；U-3900型紫外可見光分光光度計，日本日立公司；LD5-2A型離心機，北京醫(yī)用離心機廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同抗氧化劑對鱷魚油抗氧化效果的影響

采用Schaal烘箱法[8]測定鱷魚油的氧化穩(wěn)定性。取50.0 g鱷魚油于燒杯中，分別添加0.02% 的TP、VE和植酸(先用約10 mL無水乙醇溶解)，攪拌混合均勻，敞口放置于(60±1)℃恒溫干燥箱中，每隔12 h攪拌1次，間隔1 d取樣按GB 5009.227—2016測定過氧化值。每組重復(fù)測定3次，并設(shè)空白對照(未添加抗氧化劑)，比較不同抗氧化劑對鱷魚油抗氧化效果的影響。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定

分別將鱷魚油及添加0.02%抗氧化劑的鱷魚油用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的樣品，參照文獻[9]的方法測定鱷魚油的DPPH自由基清除率，以添加的抗氧化劑和VC作為陽性對照。

1.2.3 羥自由基清除能力測定

將鱷魚油及添加0.02%抗氧化劑的鱷魚油用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的樣品，按文獻[10]的方法測定鱷魚油的羥自由基清除率，以添加的抗氧化劑和VC作為陽性對照。

1.2.4 超氧自由基清除能力測定

將鱷魚油及添加0.02%抗氧化劑的鱷魚油用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的樣品，參照文獻[10]采用鄰苯三酚自氧法測定鱷魚油的超氧自由基清除率，以添加的抗氧化劑和VC作為陽性對照。

1.2.5 還原能力測定

將鱷魚油及添加0.02%抗氧化劑的鱷魚油用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的樣品，參照文獻[10]采用鐵氰化鉀法測定鱷魚油的還原能力，以添加的抗氧化劑和VC作為陽性對照。

1.2.6 二價鐵離子(Fe2+)螯合能力測定

將鱷魚油及添加0.02%抗氧化劑的鱷魚油用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的樣品，參照文獻[10]的方法測定鱷魚油的Fe2+螯合能力，以添加的抗氧化劑和VC作為陽性對照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin Pro 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計，SPSS 25.0軟件計算自由基清除率為50%時所需要的物質(zhì)的質(zhì)量濃度，即半數(shù)抑制率(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對鱷魚油的抗氧化效果

過氧化值是評價油脂氧化程度的指標(biāo)，一般過氧化值越大說明油脂的氧化程度越高。不同抗氧化劑對鱷魚油的抗氧化效果見圖1。

圖1 不同抗氧化劑對鱷魚油的抗氧化效果

由圖1可看出，在烘箱儲藏4 d內(nèi)，空白對照組與各處理組的過氧化值均隨時間的延長而升高，且空白對照組的過氧化值高于各處理組。在4～6 d時，空白對照組的過氧化值出現(xiàn)下降趨勢，而各處理組的過氧化值仍表現(xiàn)為緩慢增長趨勢，空白對照組的過氧化值顯著低于植酸和VE處理組的，而高于TP處理組的。在添加量均為0.02%時，3種天然抗氧化劑對鱷魚油的抗氧化效果表現(xiàn)為TP>VE>植酸。不同抗氧化劑的抗氧化效果存在差異可能是它們的結(jié)構(gòu)、純度及抗氧化機理等不同造成的，其中：植酸具有抗氧化、抗菌等活性，同時其磷酸基團能螯合金屬離子[11]；TP因能使未成對電子離域而具有較強活性，既能通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制氧化酶活性等直接途徑抑制油脂氧化，又能通過保護機體的內(nèi)源性抗氧化酶而起到間接的抗氧化效果[12]；VE能夠有效阻斷脂質(zhì)的過氧化連鎖反應(yīng)。綜上，選取TP為抗氧化劑，研究鱷魚油的體外抗氧化活性。

2.2 鱷魚油對DPPH自由基的清除能力(見圖2)

圖2 鱷魚油對DPPH自由基的清除能力

DPPH是十分穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，樣品的DPPH自由基清除能力能反映其抗氧化活性[13]。由圖2可知，添加TP的鱷魚油對DPPH自由基的清除率在中低質(zhì)量濃度(0～4.0 mg/mL)范圍內(nèi)急劇增長，在高質(zhì)量濃度(4.0～6.0 mg/mL)范圍內(nèi)逐漸趨于穩(wěn)定，此時DPPH自由基清除率達90%左右，且均高于鱷魚油的，添加TP的鱷魚油對DPPH自由基清除能力的IC50(0.874 mg/mL)是鱷魚油(5.448 mg/mL)的約1/6。TP、VC對照組在低質(zhì)量濃度(0～1.0 mg/mL)范圍內(nèi)，對DPPH自由基的清除率表現(xiàn)出急劇上升趨勢，之后逐漸趨于平緩，最終DPPH自由基清除率達94%左右，添加TP的鱷魚油在質(zhì)量濃度為4.0～6.0 mg/mL時的DPPH自由基清除率與二者相當(dāng)。上述結(jié)果表明，向鱷魚油中添加TP可顯著提高鱷魚油對DPPH自由基的清除能力。這可能是由于TP在乙醇溶液中會進行電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而在極性較低的鱷魚油中進行H原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)和電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，二者共同作用提高了鱷魚油對DPPH自由基的清除能力[10]。

2.3 鱷魚油對羥自由基的清除能力(見圖3)

圖3 鱷魚油對羥自由基的清除能力

羥自由基是機體內(nèi)反應(yīng)性和破壞性極強的自由基，與活細胞許多成分反應(yīng)，直接損傷各種生物大分子(核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等)和生物膜(與細胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng))，從而引起機體的損傷和衰老[14]。對羥自由基的清除能力是反映物質(zhì)抗氧化活性的重要指標(biāo)。由圖3可知,在質(zhì)量濃度為0～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，鱷魚油對羥自由基的清除率與其質(zhì)量濃度呈良好的量效關(guān)系，其IC50為0.684 mg/mL。添加TP的鱷魚油和TP、VC對照組在低質(zhì)量濃度(0～0.1 mg/mL)范圍內(nèi)對羥自由基的清除率均表現(xiàn)出急劇上升趨勢。添加TP的鱷魚油在中質(zhì)量濃度(0.1～0.3 mg/mL)范圍內(nèi)對羥自由基的清除率略有增長，在中高質(zhì)量濃度(0.3～0.6 mg/mL)范圍內(nèi)對羥自由基的清除率趨于穩(wěn)定，此時羥自由基清除率約為84%，其IC50為0.064 mg/mL，顯著低于鱷魚油(0.684 mg/mL)的。TP、VC對照組對羥自由基清除率在質(zhì)量濃度為0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi)變化不大，其中:TP對羥自由基的清除率達77%左右，低于添加TP的鱷魚油；VC對羥自由基清除率超過94%，高于添加TP的鱷魚油；但TP與VC對羥自由基的清除率均高于鱷魚油。

2.4 鱷魚油對超氧自由基的清除能力(見圖4)

圖4 鱷魚油對超氧自由基的清除能力

超氧自由基主要是通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，其具有強氧化和細胞毒性作用，能夠有效殺滅病原微生物，但如果在體內(nèi)大量聚集，會對人體健康產(chǎn)生危害，引起機體衰老，引發(fā)各項疾病[14]。對超氧自由基的清除能力是評價物質(zhì)抗氧能力的重要指標(biāo)之一。

由圖4可知，添加TP的鱷魚油對超氧自由基的清除率在中低質(zhì)量濃度(0～3.0 mg/mL)范圍內(nèi)隨其質(zhì)量濃度的增加而快速增長，在中高質(zhì)量濃度(3.0～6.0 mg/mL)范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度變化趨于穩(wěn)定，此時超氧自由基清除率約為69%，其IC50為0.96 mg/mL。鱷魚油在質(zhì)量濃度為0～6.0 mg/mL范圍內(nèi)對超氧自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度升高而上升，其IC50為4.53 mg/mL，高于添加TP的鱷魚油的。TP和VC在質(zhì)量濃度為0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)對超氧自由基的清除率呈快速上升趨勢，之后逐漸趨于平緩，此時TP對超氧自由基的清除率約為66%，與添加TP的鱷魚油相當(dāng)；VC對超氧自由基的清除率約為73%，高于添加TP的鱷魚油和鱷魚油。

2.5 鱷魚油的還原能力(見圖5)

圖5 鱷魚油的還原能力

采用鐵氰化鉀法利用分光光度計測定樣品的還原能力，吸光度越大，代表樣品還原能力越高[15]，抗氧化活性越強。由圖5可知，在低質(zhì)量濃度(0～0.1 mg/mL)范圍內(nèi)，添加TP的鱷魚油和TP、VC對照組的還原能力接近，均高于鱷魚油的。各處理組還原能力在低質(zhì)量濃度范圍增長明顯，在質(zhì)量濃度大于 0.1 mg/mL 時，隨質(zhì)量濃度增加還原能力增長速度漸緩，還原能力大小依次為VC>TP>添加TP的鱷魚油>鱷魚油。

2.6 鱷魚油的二價鐵離子(Fe2+)螯合能力(見圖6)

圖6 鱷魚油的Fe2+螯合能力

Fe2+作為過渡金屬離子，是促氧化劑，可以促進活性氧的產(chǎn)生，從而氧化一些脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和細胞組分，對機體產(chǎn)生氧化損傷。Fe2+螯合能力的大小可以反映物質(zhì)抗氧化活性的強弱，F(xiàn)e2+螯合率越大，則抗氧化活性越強[14]。由圖6可知：鱷魚油的Fe2+螯合能力隨其質(zhì)量濃度的增加而升高，呈一定的量效關(guān)系；添加TP的鱷魚油其Fe2+螯合能力隨其質(zhì)量濃度增加而快速增長，在0.5 mg/mL之后達到穩(wěn)定，此時Fe2+螯合率在83%以上，其IC50為0.175 mg/mL，約是鱷魚油的1/4。TP對照組與添加TP的鱷魚油Fe2+螯合率變化趨勢相似，但高于添加TP的鱷魚油。VC對Fe2+螯合能力最大，在質(zhì)量濃度為0～0.3 mg/mL 范圍內(nèi)Fe2+螯合率隨其質(zhì)量濃度的增加而快速增長，0.3 mg/mL后增長速度趨緩，最高約為92%，高于添加TP的鱷魚油的。TP對金屬離子具有很強的結(jié)合作用和沉淀功能[16]，因此經(jīng)TP處理后顯著提高了鱷魚油的還原能力和Fe2+螯合能力。

3 結(jié) 論

采用Schaal烘箱法探明了添加天然抗氧化劑TP、VE和植酸對鱷魚油氧化穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)三者對鱷魚油抗氧化效果強弱為TP>VE>植酸。添加TP后鱷魚油對DPPH自由基、羥自由基及超氧自由基清除能力顯著提高，F(xiàn)e2+螯合能力和還原能力也增強，表明TP能有效切斷引起鱷魚油自動氧化的自由基鏈式反應(yīng)，提高鱷魚油的抗氧化活性。