偏甘油酯脂肪酶Lipase G50的固定化及其催化高酸值米糠油乙酯化脫酸的研究

陳東升，劉 建，劉 寧，李道明

(1.中糧工科(西安)國際工程有限公司，西安 710082； 2.陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

偏甘油酯脂肪酶，與傳統(tǒng)甘油三酯脂肪酶相比，其僅能作用于甘油單酯和甘油二酯，而不能作用于甘油三酯。偏甘油酯脂肪酶獨特的甘油酯底物特異性使其近十年來在油脂改性領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。常用的偏甘油酯脂肪酶主要有PCL(來源于Penicilliumcamembertii)、SMG1(來源于Malasseziaglobose)、MgMDL2(來源于Malasseziaglobose)、AOL(來源于Aspergillusoryzae)和PcMDL(來源于Penicilliumcyclopium)[1]。與其他4種偏甘油酯脂肪酶相比，PCL的最適反應(yīng)溫度最高(40℃)，應(yīng)用范圍最廣[1-2]，而且其是5種常用偏甘油酯脂肪酶中唯一一種商品化脂肪酶(商品化名Lipase G50)。近年來Lipase G50被廣泛應(yīng)用于催化制備或去除偏甘油酯(甘油單酯、甘油二酯或甘油單酯與甘油二酯混合物)[3-11]和催化植物油環(huán)氧化[12]等。如：Freitas等[7]將固定化Lipase G50(固定于環(huán)氧SiO2-PVA上)應(yīng)用于催化甘油與脂肪酸酯化制備甘油單酯，發(fā)現(xiàn)Lipase G50對肉豆蔻酸和棕櫚酸具有較高的特異性，反應(yīng)產(chǎn)物主要為1-單甘酯，且最終的反應(yīng)混合物達到了世界衛(wèi)生組織確定的用作食品乳化劑的要求；徐揚等[9]將Lipase G50應(yīng)用于催化甘油與脂肪酸酯化制備甘油二酯，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，甘油二酯含量達44.7%；鄭平玉[10]采用Lipase G50催化甘油與油茶籽油脂肪酸酯化制備甘油二酯，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，產(chǎn)物中甘油二酯含量為49.9%；徐揚等[11]將固定化Lipase G50應(yīng)用于催化甘油與脂肪酸酯化制備甘油二酯，固定化Lipase G50連續(xù)使用5個批次后，仍能保持其最初活力的86.1%。Padhi等[8]采用Lipase G50催化轉(zhuǎn)酯化去除脂肪酸甲酯中的甘油單酯，可將飽和脂肪酸甘油單酯含量由2%降低至0.14%。除了制備和去除偏甘油酯外，Zhou等[12]研究在低共溶溶劑中采用Lipase G50催化環(huán)氧化制備環(huán)氧植物油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低共溶溶劑中，Lipase G50使環(huán)氧植物油的生產(chǎn)變得高效。而目前關(guān)于Lipase G50在其他油脂改性領(lǐng)域的應(yīng)用報道較少。

高酸值米糠油通常是指酸值(KOH)大于20 mg/g的米糠油。目前常用的脫酸方法主要有化學堿煉脫酸和物理蒸餾脫酸，前者存在中性油和脂類伴隨物損失大及產(chǎn)生工業(yè)廢水等問題[13]，后者存在能耗大及產(chǎn)生脂類風險因子(縮水甘油酯、氯丙醇酯和反式脂肪酸等)的風險[14-15]。相比于化學堿煉脫酸和物理蒸餾脫酸，采用脂肪酶催化脫除米糠油中的游離脂肪酸具有反應(yīng)條件溫和、中性油和脂類伴隨物保留率高及安全環(huán)保等優(yōu)點，近年來成為油脂脫酸領(lǐng)域的研究熱點。目前，應(yīng)用于油脂脫酸的甘油三酯脂肪酶主要為Novozym 435、Lipozyme 435、Lipozyme RM IM及Lipozyme TL IM等[16-20]，應(yīng)用于油脂脫酸的偏甘油酯脂肪酶主要為SMG1-F278N[21-22],但關(guān)于Lipase G50應(yīng)用于油脂脫酸的研究還未見報道。

本文研究了Lipase G50在高酸值米糠油脫酸中的應(yīng)用潛力?？紤]到游離酶存在穩(wěn)定性差、回收難等問題，先將Lipase G50進行固定化，對固定化的載體和載酶量進行了優(yōu)化；隨后，將固定化Lipase G50應(yīng)用于高酸值米糠油脫酸，對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，并評估了固定化Lipase G50的操作穩(wěn)定性；最后，對脫酸米糠油進行了純化，并對純化產(chǎn)物的甘油酯組成進行了測定，以期為固定化Lipase G50在高酸值米糠油脫酸中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Lipase G50(Penicilliumcamembertii游離酶，酶活力50 000 U/g)，日本天野酶制劑集團；高酸值米糠油，已脫膠處理，酸值(KOH)為62.14 mg/g，過氧化值為5.58 mmol/kg，實驗室制備；三油酸甘油酯(純度>99%)、二油酸甘油酯(純度>99%)、單油酸甘油酯(純度>99%)，上海Sigma-Aldrich有限公司；脂肪酸乙酯混標21組分(C14～C24)，美國Nu-Chek公司；牛血清蛋白，上海吉至生化科技有限公司；無水乙醇，分析純；正己烷、異丙醇、甲酸，色譜純；ECR1030樹脂、ECR8285樹脂，漂萊特(中國)有限公司；DA-201樹脂、AB-8樹脂、D380樹脂，南開大學化工廠。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；Agilent 7890A氣相色譜儀(配備氫離子化火焰檢測器)，安捷倫科技有限公司；MD-S80短程分子蒸餾，廣州漢維科技有限公司；H1650-W小型離心機；Waters 2695高效液相色譜儀(配備Waters 2414示差檢測器)，美國Waters公司；IR-35近紅外水分測定儀；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹脂預處理

樹脂ECR1030和ECR8285無需處理(廠家已處理好)。DA-201、AB-8、D380 3種樹脂采用95%乙醇浸泡趕出樹脂中的氣泡,再分別采用5% HCl和2% NaOH浸泡去除樹脂孔隙中殘留的分子單體，每次處理完成后采用去離子水沖洗樹脂，直至沖洗流出液pH為中性為止；最后采用20 mmol/L pH 5.6的磷酸鹽緩沖液浸泡樹脂，定期更換緩沖液，直至緩沖液pH不再變化為止。預處理完成后的樹脂瀝干后放于4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Lipase G50的固定化

準確稱取2 g預處理后的濕樹脂于500 mL具塞錐形瓶中，加入58.84 mL Lipase G50溶液(Lipase G50酶粉溶于20 mmol/L pH 5.6的磷酸鹽緩沖液，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1.02 mg/mL),使酶與濕樹脂的比例(載酶量)為30 mg/g，隨后加入58.84 mL20 mmol/L pH 5.6的磷酸鹽緩沖液(ECR8285樹脂實驗時加入1.5 mol/L pH 5.6的磷酸鹽緩沖液)，隨后將具塞錐形瓶置于30℃恒溫氣浴搖床中以120 r/min轉(zhuǎn)速振蕩8 h。振蕩結(jié)束后，過濾，分別收集固定化酶和濾液，收集得到的濾液測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，收集得到的固定化酶用相同的緩沖液沖洗至流出液測不出蛋白質(zhì)為止，于真空干燥箱40℃下干燥8 h，得到固定化Lipase G50。

1.2.3 蛋白吸附量的測定

采用Bradford法測定固定化前后酶溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。每組數(shù)據(jù)平行測定3次。

固定化酶蛋白吸附量(A)按式(1)進行計算。

(1)

式中：m1為固定化前Lipase G50酶溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m2為固定化后收集得到的濾液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m為干燥后固定化酶的質(zhì)量，g。

1.2.4 固定化Lipase G50酯化活力的測定

固定化Lipase G50酯化活力的測定參照諾維信標準分析方法進行。于25 mL具塞三角瓶中加入0.46 g正丙醇、1.54 g月桂酸，隨后加入6 mL正庚烷，待月桂酸溶解后加入底物總質(zhì)量3%的蒸餾水，隨后在40℃恒溫振蕩器中預熱5 min，再加入50 mg固定化Lipase G50，酯化反應(yīng)10 min后，立即取樣20 μL于980 μL正庚烷中，待氣相色譜分析。每組實驗重復3次。

GC條件：OV351色譜柱(60 m×0.32 mm×0.10 μm)；分流比40∶1；進樣量1 μL；柱前壓0.137 9 MPa；進樣口溫度250℃；FID檢測器溫度280℃；空氣流量450 mL/min，氫氣流量40 mL/min，載氣(氮氣)流量25 mL/min；升溫程序為140℃保持2 min，隨后以5℃/min升至210℃，保持15 min。采用面積歸一化法進行定量。

固定化Lipase G50酯化活力(E1)按式(2)進行計算。

(2)

E=n1/(n1+n2)

(3)

式中：I為月桂酸初始物質(zhì)的量，mol；E為月桂酸酯化率；m為固定化酶質(zhì)量，g；t為反應(yīng)時間，min;n1、n2分別為酯化產(chǎn)物中丙基月桂酸酯和月桂酸的量，mol。

固定化脂肪酶比活力(E2)按式(4)進行計算。

E2=E1/C

(4)

式中：C為固定化酶中的蛋白質(zhì)含量(固定化Lipase G50的蛋白吸附量)，mg/g。

1.2.5 固定化Lipase G50水分含量的測定

采用IR-35近紅外水分測定儀對固定化Lipase G50的水分含量進行測定。測定前，先將儀器預熱15 min，隨后稱取250 mg固定化Lipase G50置于托盤上，蓋上蓋子于110℃下測定至讀數(shù)穩(wěn)定，記錄固定化Lipase G50水分含量。

1.2.6 固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脫酸

于2.0 L反應(yīng)瓶中加入100 g高酸值米糠油，隨后加入400 mL正己烷和1/3所需無水乙醇，在250 r/min的轉(zhuǎn)速下混合均勻后，加入一定量固定化Lipase G50，開始計時，保持轉(zhuǎn)速250 r/min，在一定溫度下進行反應(yīng)。剩余2/3無水乙醇分別在反應(yīng)3 h和5 h時等量加入，反應(yīng)6 h后取樣100 μL，置于4℃冰箱，待HPLC分析其組成。

1.2.7 固定化Lipase G50的操作穩(wěn)定性評估

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下對固定化Lipase G50的操作穩(wěn)定性進行評估，每個反應(yīng)批次結(jié)束后，過濾回收固定化Lipase G50，采用10 mL正己烷沖洗3次后，用于下一批次的反應(yīng)。每次反應(yīng)結(jié)束后通過測定脫酸米糠油的酸值來評價固定化Lipase G50的操作穩(wěn)定性。

1.2.8 HPLC分析脫酸米糠油的甘油酯組成

將樣品溶于1 mL流動相中，加入0.5 g無水硫酸鈉除水，于10 000 r/min離心2 min，取800 μL上清液，進行HPLC分析。

HPLC條件：示差折光檢測器(RID)；EXL-127-2546U色譜柱(250 mm×4.6 mm)；流動相為正己烷-異丙醇-甲酸(體積比18∶1∶0.003)，流速1 mL/min；柱溫箱溫度30℃；進樣量10 μL。

各組分采用標準品定性，外標法定量。

1.2.9 放大實驗與脫酸產(chǎn)物分離純化

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進行放大實驗。以2 kg高酸值米糠油為原料，脫酸反應(yīng)結(jié)束后過濾回收固定化酶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正己烷。

本研究采用乙醇作?；荏w，將各米糠油中的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸乙酯，由于脂肪酸乙酯具有較低沸點，可通過分子蒸餾去除。因此，采用短程分子蒸餾對產(chǎn)物進行分離純化。分子蒸餾條件：進料溫度60℃，進料流量1.5 g/min，壓力1.38 Pa，蒸發(fā)面溫度120℃，刮膜速度280 r/min，冷凝水溫度35℃。

1.2.10 米糠油酸值、過氧化值的測定

米糠油酸值的測定參照GB 5009.229—2016，過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016。

2 結(jié)果與討論

2.1 Lipase G50的固定化

2.1.1 固定化載體的篩選

固定化過程中酶與載體的結(jié)合方式、結(jié)合牢固程度、酶的結(jié)合導向及載酶量等都直接影響固定化酶的活力和穩(wěn)定性[23]。按1.2.2方法采用5種樹脂對Lipase G50進行固定化，測定固定化酶的蛋白吸附量、酯化活力、比活力，考察不同樹脂對Lipase G50固定化的影響，結(jié)果如表1所示。由表1可知，與其他4種樹脂相比，ECR8285樹脂對Lipase G50進行固定化得到的固定化酶具有最高的蛋白吸附量、酯化活力和比活力，表明ECR8285更適宜于Lipase G50的固定化。采用其他4種樹脂對Lipase G50進行固定化屬于物理吸附法，而采用ECR8285對Lipase G50固定化屬于化學結(jié)合法，相比于其他幾種載體，ECR8285對Lipase G50進行固定化的過程中，Lipase G50與ECR8285的結(jié)合位點及Lipase G50固定化后的位置導向更有利于固定化Lipase G50活力的展現(xiàn)。因此，本研究選擇ECR8285樹脂對Lipase G50進行固定化。

表1 不同樹脂對Lipase G50固定化的影響

2.1.2 載酶量對Lipase G50固定化的影響

脂肪酶固定化過程中載酶量不僅影響固定化酶的活力、比活力，而且直接影響反應(yīng)的經(jīng)濟性[24]。按1.2.2方法，采用ECR8285樹脂對Lipase G50進行固定化，改變Lipase G50溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，得到不同載酶量的固定化酶，測定固定化酶的蛋白吸附量、酯化活力和比活力，考察載酶量對Lipase G50固定化的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 載酶量對Lipase G50固定化的影響

由圖1可以看出：蛋白吸附量隨著載酶量的增加而增加，當載酶量達到40 mg/g時，蛋白吸附量達到平衡，表明ECR8285對Lipase G50的結(jié)合達到飽和；固定化Lipase G50的酯化活力隨著載酶量的增加而增加，當載酶量達到35 mg/g時，增加幅度放緩，這可能是由于隨著ECR8285上Lipase G50結(jié)合量的增加，酶分子彼此之間相互影響，從而影響了固定化酶酯化活力的增加；固定化Lipase G50的比活力隨著載酶量的增加而降低，可能是由于隨著蛋白吸附量的增加，酶分子之間相互影響，增加了酶分子與底物分子結(jié)合的空間位阻，從而引起固定化酶比活力的下降。綜合考慮，選擇載酶量為40 mg/g制備固定化Lipase G50。

在上述優(yōu)化條件下，對Lipase G50的固定化實驗放大50倍，得到的固定化酶蛋白吸附量為33.14 mg/g，酯化活力為518.66 U/g，比活力為15.65 U/mg，水分含量為1.98%。

2.2 固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脫酸的單因素實驗

2.2.1 無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比對脫酸的影響

在反應(yīng)溫度35℃、酶加量30 U/g(基于高酸值米糠油的質(zhì)量，下同)、反應(yīng)時間6 h條件下，研究無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比對固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脫酸的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比對脫酸的影響

由圖2可以看出，當無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比為1∶1時，脫酸米糠油的酸值(KOH)最高，達12.74 mg/g。這主要是由于高酸值米糠油中除了含大量的游離脂肪酸(30.68%)外，還含有一定量的偏甘油酯(0.25%甘油單酯和9.22%甘油二酯)，當采用固定化Lipase G50作催化劑、無水乙醇作?；荏w催化高酸值米糠油脫酸時，無水乙醇除了與游離脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)外還會與偏甘油酯發(fā)生醇解反應(yīng)，所以當無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比為1∶1進行脫酸時，無水乙醇的添加量遠不能滿足脫酸反應(yīng)的需要，所以脫酸后米糠油的酸值仍然較高。當無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比為1.5∶1時，脫酸米糠油的酸值(KOH)降至2.87 mg/g；進一步增加無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比至2∶1時，脫酸米糠油的酸值(KOH)降至0.66 mg/g，然而當無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比增加至2.5∶1時，脫酸后米糠油的酸值(KOH)為1.21 mg/g，與2∶1時相比略有升高，這可能是由于過高的無水乙醇添加量，影響了固定化Lipase G50的酯化活力，從而降低了固定化Lipase G50的脫酸效果。因此，選擇無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比為2∶1。

2.2.2 酶加量對脫酸的影響

在無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比2∶1、反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)時間6 h條件下，研究酶加量對固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脫酸的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶加量對脫酸的影響

由圖3可知，隨著酶加量的增加脫酸效果逐漸變好。當酶加量為40 U/g時，脫酸米糠油的酸值(KOH)降至0.31 mg/g，盡管酶加量為50 U/g時，脫酸米糠油的酸值(KOH)降至0.27 mg/g，但與酶加量40 U/g相比沒有顯著差異(p>0.05)，這可能是由于當酶加量為40 U/g時，酶與底物已基本達到飽和，進一步增加酶加量并不會顯著增強脫酸效果。出于經(jīng)濟性的考慮，選擇酶加量為40 U/g。

2.2.3 反應(yīng)溫度對脫酸的影響

在無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比2∶1、酶加量40 U/g、反應(yīng)時間6 h條件下，研究反應(yīng)溫度對固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脫酸的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)溫度對脫酸的影響

由圖4可知，隨反應(yīng)溫度升高，脫酸米糠油的酸值先降低后升高。固定化Lipase G50在反應(yīng)溫度40℃時具有最優(yōu)的脫酸效果，脫酸米糠油的酸值(KOH)降至0.12 mg/g。反應(yīng)溫度超過40℃后，脫酸米糠油的酸值增加，這可能是由于一方面高溫影響了固定化Lipase G50的反應(yīng)活力(因為游離Lipase G50的最適反應(yīng)溫度為37℃)，另一方面，高溫加速了反應(yīng)底物乙醇的揮發(fā)，從而使脫酸效果降低。因此，選擇反應(yīng)溫度為40℃。

綜上，確定固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脫酸的最佳反應(yīng)條件為：無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比2∶1，酶加量40 U/g，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間6 h。

2.3 固定化Lipase G50的操作穩(wěn)定性

在上述優(yōu)化的反應(yīng)條件下，以每個批次結(jié)束后脫酸米糠油的酸值為指標，研究固定化Lipase G50的操作穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 固定化Lipase G50的操作穩(wěn)定性

由圖5可知，固定化Lipase G50連續(xù)使用10個批次后，脫酸效果與第一個批次相比沒有顯著差異(p>0.05)。進一步對10個批次結(jié)束后回收得到的固定化Lipase G50的酯化活力進行分析發(fā)現(xiàn)，固定化Lipase G50的酯化活力為509.22 U/g，與初始制備得到的固定化Lipase G50的酯化活力(518.66 U/g)相比沒有顯著差異，表明固定化Lipase G50在催化高酸值米糠油脫酸過程中具有優(yōu)異的操作穩(wěn)定性。

2.4 放大實驗與產(chǎn)物分離純化

2 kg高酸值米糠油經(jīng)酶法脫酸放大實驗、分子蒸餾，得到1.16 kg脫酸米糠油和0.83 kg脂肪酸乙酯，米糠油精煉得率為58%。高酸值米糠油、脫酸米糠油及分子蒸餾純化產(chǎn)物的甘油酯組成如表2所示。

表2 高酸值米糠油、脫酸米糠油及分子蒸餾純化產(chǎn)物的甘油酯組成 %

由表2可知，脫酸米糠油的游離脂肪酸含量降至0.06%(酸值(KOH)為0.12 mg/g)，分子蒸餾純化產(chǎn)物中游離脂肪酸含量為0.10%，甘油三酯含量為97.58%。高酸值米糠油經(jīng)脫酸、分子蒸餾純化后，酸值(KOH)由62.14 mg/g降至0.19 mg/g，過氧化值由5.58 mmol/kg降至2.16 mmol/kg，酸值和過氧化值均達到了GB/T 19112—2003一級米糠油標準。結(jié)果表明固定化Lipase G50是催化高酸值米糠油脫酸的有效催化劑，在油脂脫酸領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

本文探究了固定化Lipase G50在高酸值米糠油脫酸中的應(yīng)用潛力。首先篩選了適宜的固定化載體，發(fā)現(xiàn)環(huán)氧樹脂ECR8285對Lipase G50的固定化效果最好，在載酶量為40 mg/g時，制備的固定化Lipase G50的酯化活力達到518.66 U/g。將制備的固定化Lipase G50應(yīng)用于高酸值米糠油脫酸，最佳脫酸工藝條件為：無水乙醇與游離脂肪酸物質(zhì)的量比 2∶1，酶加量40 U/g，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間6 h。在最佳脫酸條件下，高酸值米糠的酸值(KOH)由62.14 mg/g降至0.12 mg/g，且在脫酸過程中固定化Lipase G50展現(xiàn)出了優(yōu)異的操作穩(wěn)定性，連續(xù)使用10個批次后，固定化Lipase G50的酯化活力為509.22 U/g，與初始固定化Lipase G50相比，酯化活力沒有顯著降低。分子蒸餾純化產(chǎn)物的酸值(KOH)為0.19 mg/g，過氧化值為2.16 mmol/kg，達到了一級米糠油標準。因此，固定化Lipase G50在油脂脫酸領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。