血漿-凝血酶法制備液基細胞學(xué)剩余標(biāo)本細胞蠟塊在惡性腫瘤病理診斷中的應(yīng)用

賀 妍，吉曉霞，李曉娟，欒中華，余紅梅

(1山西醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，太原 030001；2山西省運城市中心醫(yī)院病理科；*通訊作者,E-mail:yu@sxmu.edu.cn)

細胞蠟塊(cell block, CB)是指從細胞學(xué)標(biāo)本(漿膜腔積液、細針穿刺等)中收集沉淀物、血凝塊或肉眼可見的組織塊，這些組織塊被加工成石蠟塊，通常用蘇木精-伊紅染色(HE染色)[1]。目前，細胞蠟塊已經(jīng)廣泛用于細胞學(xué)診斷工作中，是細胞學(xué)的重要組成部分，主要用于腫瘤的溯源和分類[2]。在細胞學(xué)標(biāo)本量足夠、惡性腫瘤細胞量充足的情況下，本實驗室通常采用離心沉淀法制備細胞蠟塊。實際工作中偶爾會遇見一些極端情況，由于各種原因(如腫瘤患者高齡、惡液質(zhì)等)無法獲取足量細胞學(xué)標(biāo)本，患者更不可能耐受活檢等創(chuàng)傷更大的檢查。有限的標(biāo)本完成液基細胞學(xué)制片后，剩余標(biāo)本不能通過直接離心包埋成蠟塊，導(dǎo)致后續(xù)對腫瘤定性分型、指導(dǎo)治療相關(guān)檢查(如免疫細胞化學(xué)、分子檢測等)無法開展。因此，針對量少細胞學(xué)標(biāo)本，迫切需要尋找一種實用的細胞蠟塊制備方法。針對此種情況，本實驗室將液基細胞學(xué)與血漿-凝血酶法結(jié)合起來，探尋出一種簡單快速、成本低且制片效果良好，同時能滿足后續(xù)相關(guān)檢查保證精準(zhǔn)診斷的細胞蠟塊制備法。此種方法可避免病人重復(fù)有創(chuàng)性檢查的痛苦，實現(xiàn)標(biāo)本利用最大化，經(jīng)實踐證明，在惡性腫瘤的診療中發(fā)揮積極作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集運城市中心醫(yī)院病理科2021年1—7月液基細胞學(xué)制片后剩余標(biāo)本87例。其中包括漿膜腔積液24例，肺泡灌洗液21例，甲狀腺細針穿刺16例，腹腔沖洗液15例，尿液8例，痰液3例。

1.2 主要試劑

PreservCyt?細胞清洗液(新柏氏公司細胞清洗液，用于去除體液標(biāo)本中紅細胞、黏液等)；PreservCyt?細胞保存液(新柏氏公司細胞保存液，用于體液標(biāo)本離心后細胞長期保存)；凝血酶時間(TT)測定試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司、8/10×2.5 ml規(guī)格)；新鮮冰凍血漿(來源于無償獻血枸櫞酸鈉抗凝新鮮血漿)；4%中性緩沖福爾馬林；免疫細胞化學(xué)試劑CK7、TTF-1、p63等一抗抗體購于福州邁新生物技術(shù)有限公司；二抗抗體購于中杉金橋公司(Ultra PATH Plus DAB染色液)。

1.3 主要材料

20 ml離心管、一次性滴管、塑料包埋盒。

1.4 主要儀器

高速離心機、脫水機、包埋機、切片機、自動染色機。免疫細胞化學(xué)采用中杉金橋Ultra PATH自動免疫組織化學(xué)染色機(設(shè)備型號：Ultra 60)。

1.5 方法

本試驗采用雙盲法，即技術(shù)員和診斷醫(yī)師均不知曉標(biāo)本液基細胞學(xué)診斷結(jié)果。

1.5.1 血漿-凝血酶法細胞蠟塊制備 制備細胞蠟塊操作如下：①凝血酶試劑配置：按試劑盒說明書要求，每瓶凝血酶凍干粉加入2.5 ml緩沖液，靜置5～10 min，輕搖溶解。②將液基細胞樣本瓶中剩余液體倒入20 ml離心管中，3 000 r/min離心5 min后，倒掉上清液，剩余細胞沉渣備用。③離心管中加入與細胞沉渣相適量的新鮮血漿，充分混勻后，加入等體積配置好的凝血酶。靜置數(shù)秒，可見固體細胞團塊形成后，將團塊輕輕倒在包埋紙上，包好放入密孔型包埋盒內(nèi)，立即投入4%中性緩沖福爾馬林固定4 h。④充分固定后，將包埋盒放入脫水機進行常規(guī)脫水。

1.5.2 HE切片制備和免疫細胞化學(xué)染色 細胞蠟塊常規(guī)脫水后，第2天進行石蠟包埋、切片、HE染色、鏡檢。針對陽性及可疑陽性標(biāo)本，根據(jù)診斷需要選擇免疫細胞化學(xué)抗體。免疫細胞化學(xué)染色在中杉金橋Ultra PATH自動免疫組化機上完成。鏡下觀察。

1.5.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以病理活檢為“金標(biāo)準(zhǔn)”，采用SPSS 25軟件對檢測結(jié)果進行配對四格表χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

87例標(biāo)本中成功制備細胞蠟塊83例，成功率95.4%(83/87)。83例細胞蠟塊中有活檢病理結(jié)果75例。二者診斷結(jié)果對比后，69例一致，6例不符，診斷正確率為92.0%(69/75)。

2.1 常規(guī)HE染色結(jié)果

83例標(biāo)本細胞蠟塊制片后，切片染色清晰，對比度明顯(見圖1)。

A.胸腔積液細胞蠟塊中乳腺癌細胞(HE,×100)；B.腹腔沖洗液細胞蠟塊中惡性腫瘤細胞(HE,×200)，經(jīng)術(shù)后病理及外出會診確診為惡性混合性苗勒腫瘤；C.胸腔積液細胞蠟塊中血管肉瘤細胞(HE,×200)；D.甲狀腺細針穿刺細胞蠟塊中甲狀腺乳頭狀癌細胞(HE,×200)；E.肺泡灌洗液細胞蠟塊中肺小細胞癌細胞團(HE,×200)；F.尿液細胞蠟塊中乳頭狀結(jié)構(gòu)(HE,×200)；G.痰液細胞蠟塊中小細胞肺癌細胞團(HE,×200)圖1 不同來源標(biāo)本細胞蠟塊切片HE染色效果Figure 1 HE staining of cell blocks from different samples

2.2 免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果

染色背景清晰，陽性表達信號定位準(zhǔn)確，均勻分布，對比度明顯(見圖2)。

A.肺腺癌心包積液細胞蠟塊常規(guī)染色(HE,×400)；B.肺腺癌免疫細胞化學(xué)染色CK7(+)(ICC,×400)；C.肺腺癌免疫細胞化學(xué)染色TTF-1(+)(ICC,×400)；D.肺腺癌免疫細胞化學(xué)染色p63(-)(ICC,×400)；E.小細胞肺癌胸腔積液細胞蠟塊常規(guī)染色(HE,×100)；F.小細胞肺癌免疫細胞化學(xué)染色TTF-1(+)(ICC,×200)；G.小細胞肺癌免疫細胞化學(xué)染色CD56(+)(ICC,×200)；H.小細胞肺癌免疫細胞化學(xué)染色Syn(+)(ICC,×200)；I.小細胞肺癌免疫細胞化學(xué)染色Ki-67(70%+)(ICC,×200)圖2 肺腺癌心包積液和小細胞肺癌胸腔積液細胞蠟塊的HE及免疫細胞化學(xué)染色Figure 2 HE and ICC staining of cell blocks from pericardial effusion of lung adenocarcinoma and pleural effusion of small cell lung cancer

2.3 病理診斷結(jié)果

87例標(biāo)本中有活檢病理結(jié)果共75例。細胞蠟塊與活檢結(jié)果采用SPSS 25進行配對四格表χ2檢驗分析，結(jié)果顯示兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.219，見表1)。

表1 細胞蠟塊與活檢病理診斷結(jié)果 (例)

3 討論

惡性腫瘤的細胞病理學(xué)診斷中，細胞蠟塊有效彌補了液基細胞制片的缺點。細胞蠟塊清晰度高，細胞量大，保存了細胞原有的排列方式和結(jié)構(gòu)，免疫細胞化學(xué)及分子檢測陽性率高且標(biāo)本可以長期保存[3-5]。因此，目前采用液基細胞學(xué)制片和細胞蠟塊聯(lián)合使用以提高惡性腫瘤診斷準(zhǔn)確性[6]。細胞蠟塊可以充分利用送檢材料完成更多的檢查工作，對患者的創(chuàng)傷性更低，特別適用于因各種原因無法獲取活檢標(biāo)本的惡性腫瘤病人[7]。細胞蠟塊制備方法有多種，如玻片法、離心沉淀法、添加填充劑法等，每種方法各有其優(yōu)缺點[8,9]。國內(nèi)外各實驗室針對不同類型標(biāo)本也在不斷摸索新的方法，以解決現(xiàn)有方法的不足[10-13]。但現(xiàn)有文獻少有針對液基細胞學(xué)剩余標(biāo)本細胞蠟塊制備方法的研究，本實驗室經(jīng)過長期探索，尋找到一種適合的細胞蠟塊制備方法:血漿-凝血酶法。

凝血酶與血漿混合可以促進纖維蛋白形成支架，將注入血漿中的細胞網(wǎng)羅其中。對比其他方法，本次研究發(fā)現(xiàn)血漿-凝血酶法制備液基細胞學(xué)剩余標(biāo)本細胞蠟塊在惡性腫瘤的診斷中具有以下優(yōu)勢：①解決了患者因標(biāo)本量少、無法通過直接離心法制備細胞蠟塊的困境，可得到細胞量充足的蠟塊，為更多的惡性腫瘤患者爭取診斷和治療機會。本次研究87例標(biāo)本中，成功制備細胞蠟塊83例，成功率95.4%。②采用液基細胞學(xué)剩余標(biāo)本，前期處理去除了標(biāo)本內(nèi)紅細胞、黏液等干擾成分，高度集中保留了惡性腫瘤細胞。③血漿、凝血酶混合后形成纖維蛋白，隨后不斷收縮，網(wǎng)羅在其中的細胞在脫水包埋過程中不易松散破碎，有效避免了細胞丟失，實現(xiàn)惡性腫瘤患者細胞學(xué)標(biāo)本利用最大化。④蠟塊制備在離心管內(nèi)完成，整個過程標(biāo)本未暴露于空氣中，有效避免蠟塊本身被污染，同時生物安全性高。⑤不需購置額外設(shè)備，節(jié)約科室成本，從而節(jié)約患者診斷費用。⑥可立即包埋成塊，無需等待，為技術(shù)員節(jié)省時間。此方法制備1例細胞蠟塊大約僅需10～15 min。⑦細胞分布集中、不松散，切片中細胞密度高，便于診斷醫(yī)師鏡下觀察，利于惡性腫瘤的診斷。⑧細胞結(jié)構(gòu)清晰、完整，免疫細胞化學(xué)表達良好、定位準(zhǔn)確。75例標(biāo)本診斷結(jié)果與活檢結(jié)果對比后，診斷正確率92.0%，診斷準(zhǔn)確度高。

6例標(biāo)本診斷結(jié)果與活檢不符。其中誤診1例，術(shù)前診斷為可疑甲狀腺乳頭狀癌，術(shù)后病理結(jié)果為橋本氏甲狀腺炎，且細胞增生活躍異型性明顯。漏診5例，分別為腹腔沖洗3例，甲狀腺細針穿刺1例，肺泡灌洗液1例。其中2例腹腔沖洗液漏診原因為患者處于腫瘤早期，腹腔尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移。另外1例腹腔沖洗液和肺泡灌洗液漏診原因為送檢標(biāo)本中惡性細胞量少，尚不足以明確診斷為惡性腫瘤細胞。1例甲狀腺細針穿刺術(shù)后病理證實為甲狀腺乳頭狀癌濾泡亞型，漏診原因為細胞蠟塊切片中細胞形態(tài)不夠典型，尚不足以診斷為惡性。所有誤診與漏診病例與送檢標(biāo)本質(zhì)量、腫瘤類型及組織學(xué)形態(tài)特征有關(guān)，與本方法無關(guān)。

每種方法均有優(yōu)缺點，在應(yīng)用過程中，發(fā)現(xiàn)此法存在以下不足。首先，當(dāng)液基細胞學(xué)剩余標(biāo)本量過少(低于5 ml)時，細胞蠟塊無法獲得滿意細胞量，這也是87例標(biāo)本中6例標(biāo)本細胞蠟塊制備失敗原因所在。此情況在相關(guān)文獻也有報道[14]。其次，本方法用到PreservCyt?細胞保存液，有文獻報道其固定效果不如福爾馬林和95%酒精[15]。最后，Sung等[16]的研究表明，人類血漿可能是潛在的DNA污染源，盡管污染可能性很低，但不能排除導(dǎo)致錯誤結(jié)果的可能性。針對上述缺點還需后續(xù)不斷研究探討，以改良方法。

綜上所述，使用血漿-凝血酶法制備液基細胞學(xué)剩余標(biāo)本細胞蠟塊，在細胞量、細胞密度、節(jié)約成本和時間、蠟塊制備成功率、惡性腫瘤診斷準(zhǔn)確率等方面均有優(yōu)勢，可在惡性腫瘤患者診斷及治療中發(fā)揮積極作用。在無法獲取更多滿意標(biāo)本的情況下，可考慮推廣開展。